用于抗生素恩诺沙星和环丙沙星同步检测的抗体-荧光纳米微球偶合物及其制备方法与流程

本发明涉及食品、农业和环境等行业的快速检测分析，具体涉及用于抗生素恩诺沙星和环丙沙星同步检测的抗体-荧光纳米微球偶合物及其制备方法。

背景技术：

1、恩诺沙星是第三代氟喹诺酮类广谱抗菌药。由于碱性分子的逐渐变化，恩诺沙星的抗菌性能大大提高，被广泛应用于畜禽、水产等动物的细菌和支原体感染防治。恩诺沙星在被使用后能够在动物体内代谢成为环丙沙星，根据国家食品中兽药残留限量标准，恩诺沙星在动物体内的残留限量指的是恩诺沙星本体和其代谢物环丙沙星的总和，其最高残留限量值为0.1 mg/kg。恩诺沙星不科学的滥用会引发药物残留，经过食物链从而对人类健康产生很大危害。因此，针对食品动物检测其上市期间恩诺沙星的残留量一直是农业农村部门和市场监督部门为保障食品质量安全的必备日常任务。

2、目前，针对食品动物体内残留的恩诺沙星和环丙沙星的检测方法是基于酶联免疫方法和胶体金方法，这些方法的检测步骤是“一指标、一提取、一读数”。一个残留限量的判断需要对两个指标分别进行检测，既费工也费钱。本发明基于抗原抗体特异性结合的免疫反应原理，将荧光纳米微球分别与两种抗生素的抗体偶联在一起，形成偶合物，同时检测两种偶合物的荧光信号强度，实现恩诺沙星和环丙沙星两种抗生素的同步快速定量检测。

3、

技术实现思路

1、解决的技术问题：针对现有技术中恩诺沙星和环丙沙星的检测需要对两个指标分别进行检测既费工又费钱的问题，本发明提供一种用于抗生素恩诺沙星和环丙沙星同步检测的抗体-荧光纳米微球偶合物及其制备方法，将荧光纳米微球分别与两种抗生素的抗体偶联在一起，形成偶合物，同时检测两种偶合物的荧光信号强度，可实现恩诺沙星和环丙沙星两种抗生素的同步快速定量检测。

2、技术方案：用于抗生素恩诺沙星和环丙沙星同步检测的抗体-荧光纳米微球偶合物的制备方法，步骤如下：

3、步骤一.制备荧光微球，将粒径为100~500 nm的聚苯乙烯微球通过水解的方式在表面上进行羧基化修饰，再利用包埋的方式，将稀土铕元素包埋在微球内部形成聚苯乙烯微球与铕元素的联合体得到荧光微球，通过检测，该荧光微球性能为：激发波长360至365nm，发射波长610至620 nm；在水相中分散度良好；

4、步骤二.构建荧光微球的预处理体系，对荧光微球进行清洗和活化，清洗时，将100μl的荧光微球移至2 ml的离心管中，并加入400~900μl清洗溶液，功率300 w、频率40 khz条件下超声混匀5~10 min，结束后，5000~20000 r/min的速度离心10~20 min去除上清液，再加入400~900 μl清洗溶液至离心管中，功率300 w、频率40 khz条件下超声混匀5~8 min，随后进行活化，将清洗步骤得到的离心管中分别加入20~100 μl活化溶液，涡旋混匀，置于混匀器上室温旋转孵育20~40 min，得到盛有活化后的荧光微球离心管；

5、步骤三. 荧光微球与抗体进行偶联，将盛有活化后的荧光微球离心管在5000~20000 r/min转速下进行离心10~20 min，去除上清液，重复2遍上述清洗步骤后，加入400~900 μl微球偶联缓冲液，超声混匀5~10 min，然后加入0.05~0.1 mg抗恩诺沙星或抗环丙沙星单克隆抗体，涡旋混匀，置于混匀器上室温旋转孵育1~2 h，结束后，5000~20000 r/min的速度离心10~20 min，去除上清液，随后加入1 ml微球封闭液，置于混匀器上室温旋转孵育1~2 h，结束后，5000~20000 r/min的速度离心10~20 min，去除上清液，沉淀重复前述步骤用微球封闭液再清洗一次，然后，加入1 ~2 ml的微球悬浮液，混合均匀，功率300 w、频率40khz条件下超声波分散5 min，至此，荧光微球与抗恩诺沙星单克隆抗体或抗环丙沙星单克隆抗体的偶联完成，分别制备得到恩诺沙星抗体-荧光微球偶合物和环丙沙星抗体-荧光微球偶合物；

6、步骤四. 制备完成的产品2~8 ℃避光保存。

7、作为优选，所述步骤一中水解和包埋的具体过程如下：向100 ml玻璃容器中依次加入聚苯乙烯微球25 mg/ml、十二烷基磺酸钠7 mg/ml、过硫酸钾15mg/ml，用去离子水溶解，超声混合均匀，总体积为20 ml，然后加入甲醇1.5 ml，十一烯酸1.0 ml，混匀；通氮气，密封，放入70℃恒温水浴箱中振荡反应4 h，反应结束后将微球离心，醇洗、水洗各三次，真空干燥保存得到羧基化聚苯乙烯微球；取上述过程中制备的羧基化聚苯乙烯微球0.1 g，加入10 ml去离子水/丙酮混合液(v/v，1:1)，于28 ℃振荡10 h，然后加入0.5 ml 0.25 m三氯化铕-乙醇溶液，28 ℃振荡反应20 h，最后通过旋转蒸发除去有机溶剂，产物经5000~10000r/min离心分离3 min，用去离子水和乙醇淋洗3次，最后用含有0.05wt%叠氮钠的水复溶4℃保存即得到荧光微球。

8、作为优选，所述步骤二中清洗溶液的制备方法如下：将 2-（n-吗啉代）乙磺酸溶于超纯水， 2-（n-吗啉代）乙磺酸与超纯水的比值为1.066 g:100 ml，用5 m naoh溶液调ph至6.0，得到终浓度为50 mm，ph为6.0的清洗溶液。

9、作为优选，所述步骤二中活化溶液包括a液和b液，a液为n-羟基琥珀酰亚胺的乙醇溶液，n-羟基琥珀酰亚胺与乙醇的比值为10 mg:1 ml，b液为1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的乙醇溶液，1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与乙醇的比值为10 mg:1 ml。

10、作为优选，将清洗步骤得到的离心管中分别加入10~50 μl活化溶液a和10~50 μl活化溶液b，涡旋混匀。

11、作为优选，所述步骤三中微球偶联缓冲液的制备方法为：将2-（n-吗啉代）乙磺酸溶于超纯水，2-（n-吗啉代）乙磺酸与超纯水的比值为0.213 g:100 ml，用5 mnaoh溶液调ph至6.0，得到终浓度为10 mm，ph为6.0的微球偶联缓冲液；所述微球封闭液的制备方法为：将bsa溶于微球偶联缓冲液，bsa与微球偶联缓冲液的比值为50 mg:10 ml；所述微球悬浮液的制备方法为：分别取海藻糖、bsa和聚乙烯吡咯烷酮pvp -k30溶于微球偶联缓冲液，再加入吐温-20和proclin300防腐剂混匀即可，其中海藻糖、bsa、聚乙烯吡咯烷酮pvp -k30、微球偶联缓冲液、吐温-20和proclin300防腐剂的比值为0.5~1g:0.1~0.5 g:0.1~0.5 g:10 ml:10~50 μl:10μl。

12、基于上述方法制备的用于抗生素恩诺沙星和环丙沙星同步检测的抗体-荧光纳米微球偶合物。

13、上述抗体-荧光纳米微球偶合物在同步检测抗生素恩诺沙星和环丙沙星中的应用。

14、具体检测方法如下：（1）制备用于抗生素恩诺沙星和环丙沙星同步检测的免疫荧光层析检测卡，所述检测卡包括底板、设置于底板上的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸垫，所述硝酸纤维素膜上表面从下到上依次划有环丙沙星包被抗原（检测线t2）、恩诺沙星包被抗原（检测线t1）和兔抗鸡igy（质控线c）三条线，硝酸纤维素膜的两端分别搭接有样品垫和吸水纸垫，其中，硝酸纤维素膜的一端紧压硝酸纤维素膜边缘2 mm处粘贴吸水纸垫，在硝酸纤维素膜的另一端紧压硝酸纤维素膜边缘2 mm处粘贴样品垫，然后切成宽度4 mm的试纸条，装入检测卡下盖的试纸条槽内，盖上检测卡上盖即可；

15、（2）将环丙沙星抗体-荧光纳米微球、恩诺沙星抗体-荧光纳米微球和兔抗鸡igy多克隆抗体-荧光纳米微球三种微球用含1wt%吐温-20-pbs溶液配制成一定倍数的工作溶液；

16、（3）检测标曲的制备系列标准品配制：取恩诺沙星标准品和环丙沙星标准品用上述（2）中配制的样品稀释液配制恩诺沙星/环丙沙星标准品系列浓度：0/0、0.05/0.25、0.45/2.25、4.05/20.25 ng/ml，取100 μl加入到检测卡中，于室温（25℃左右）静置10 min，然后采用时间分辨荧光免疫分析仪读数，即可得到检测线t与质控c线的比值（t/c）。

17、有益效果：本发明提供一种用于抗生素恩诺沙星和环丙沙星同步检测的抗体-荧光纳米微球偶合物及其制备方法，利用该方法制备出来的偶合物不仅能够实现目标抗生素检测灵敏度的大幅度提升，更能够完全屏蔽两种抗生素在同步检测时的交叉性。

18、