AKR1B10在胃肠道疾病中的应用及其检测试剂盒的制作方法

本发明涉及医药生物，具体地说，涉及了一种醛酮还原酶1b10(akr1b10)蛋白以及基于akr1b10蛋白开发的醛酮还原酶1b10测定试剂盒(磁微粒化学发光法)，用于胃肠道疾病的筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测。

背景技术：

1、醛酮还原酶1b10(aldo-keto reductase 1b10，akr1b10)蛋白最先从人类原发性肝癌组织中分离鉴定出来，akr1b10基因定位在染色体7q33，编码一个由316个氨基酸组成的蛋白，分子量为36.02kda。现有研究已证明其在多种人类肿瘤组织中高表达，并促进肿瘤细胞的生长与增殖(原发性肝细胞肝癌、肺癌、乳腺癌等)。akr1b10蛋白可由溶酶体介导的非经典分泌途径，从肿瘤细胞中分泌进入血液循环。其功能主要为保护细胞免于羧基毒性损伤；以及稳定乙酰辅酶a羧化酶α(accα)阻止accα降解，从而调节脂肪酸与脂质合成，促进肿瘤细胞的生长增殖和迁移。

2、人体内胃肠道系统是消化食物、吸收营养和排泄废物的主要器官，包括胃、十二指肠、小肠、结肠。胃肠道疾病的发生与个人的饮食和生活习惯密切相关，由于工作和生活的强度大，经常加班熬夜，长期缺乏充足的休息，且过量食用高脂高油和辛辣食物，过量饮酒，再加之饮食起居不规律，导致胃肠道不堪重负。近年来胃肠道疾病人群越来越多，临床上常见各不同类型的急慢性胃肠道炎症，如果诊断和干预治疗不及时，病情极可能进展为良性或恶性肿瘤，严重影响生活质量。

3、胃是消化食物的主要器官，胃部疾病主要包括良性疾病和恶性疾病，其中良性疾病包括胃炎、胃溃疡等，恶性疾病主要指原发性胃癌和转移性胃癌。临床表现主要为上腹部饱胀疼痛、胃部反酸、胃部灼烧感、食欲不振、恶心乏力、腹痛腹泻，严重者体型消瘦、血便等。肠道是人体内最主要的消化和吸收器官，肠道疾病是临床中一种常见的肛肠类疾病，包括有阑尾炎、肠梗阻、肠粘连、肠痉挛、溃疡性肠炎、克罗恩病、结直肠癌等。其临床症状多以食欲不振、恶心呕吐、腹痛腹泻和便秘等。引起肠道疾病的因素多种多样，一般和患者的饮食、生活习惯等密切相关。肠道菌群也是导致肠道疾病的关键因素，肠道内有益菌群减少，有害菌群增多，打乱肠道菌群平衡，诱发肠道疾病。

4、临床上对胃肠道疾病的检测与诊断，除常规的幽门螺旋杆菌、胃泌素等血清检测之外，最主要的方式还是通过胃镜、肠镜或x射线钡餐检查。但上述检查方式成本费用高，患者的依从性差，不利于临床大规模的筛查使用。本发明人最新研究发现，akr1b10在健康人的胃肠道粘膜、胃肠液或大便中表达，在发生炎症或其他病变的胃肠道疾病患者中，akr1b10蛋白低表达或不表达。因此，通过检测akr1b10蛋白水平，可辅助诊断胃肠道疾病的发生与进展。

技术实现思路

1、通过本发明研究发现，akr1b10主要在健康人的胃肠道粘膜组织中表达，而在发生炎症或癌变等的胃肠道组织中不表达或低表达；akr1b10在健康人的胃液、肠液和大便中可检测到，但在胃肠道病人中下降。通过检测akr1b10蛋白水平(akr1b10氨基酸序列见seqidno.1)，可以提示胃肠道疾病的发生发展，及治疗和预后情况。

2、针对上述问题，本发明人开发了一种检测akr1b10蛋白的醛酮还原酶1b10测定试剂盒(磁微粒化学发光法)，该试剂盒将化学发光技术与磁分离技术相结合，用于受试者胃液、肠液、大便或组织样本中的akr1b10蛋白的检测，通过检测akr1b10蛋白水平，可以提示胃肠道疾病的发生发展，及治疗和预后情况。

3、具体而言，本发明涉及如下内容：

4、1.本发明提供一种醛酮还原酶1b10(akr1b10)蛋白在制备用于胃肠道疾病的筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测的试剂中的应用，所述胃肠道疾病包括急性胃炎、慢性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、溃疡性结肠炎、克罗恩病、胃癌和结直肠癌。

5、2.本发明研发了特异性识别akr1b10抗原的两株单克隆抗体。

6、2.1.akr1b10抗原免疫小鼠

7、用纯化的akr1b10全长蛋白抗原1.0mg，加入等体积弗氏佐剂，2只6～8周龄的健康雄性鼠，分三次免疫，每次间隔两周，每次将300μl乳化好的akr1b10特异抗原注射到小鼠皮下与腹腔，每隔2周进行一次免疫，免疫剂量和途径均不变。在进行细胞融合前3天，将抗原与pbs直接混合不添加任何佐剂，每只300μl直接注射到小鼠腹腔进行加强免疫。

8、2.2免疫小鼠效价检测

9、在小鼠免疫一周后，尾静脉取血0.1ml检测抗体效价。将获取的0.1ml血液37℃静置1h，置于4℃过夜，再以10,000rpm离心10min，吸取上层淡黄色液体即为鼠抗akr1b10血清。以0.1μg/ml浓度的akr1b10抗原包被酶标板，每孔加入100μl包被液，37℃包被2小时，并封闭晾干。将鼠抗akr1b10血清以0；1:100；1:500；1:2000；1:4000；1:8000；1:16000；1:32000稀释，每孔100μl孵育1小时，pbs溶液作为对照。再加入羊抗鼠二抗作为检测抗体，以tmb溶液显色，测定od450值。通过计算阳性孔中od450与pbs阴性孔的比值，以p/n≥2的结果作为最大有效稀释倍数，即抗体最大效价(p为阳性值，n为阴性值，当p/n≥2时，即为有效稀释效价)。经过检测，确定鼠抗akr1b10血清中最大效价可达到1:16000，测定结果符合＞1:10000要求。

10、2.3杂交瘤细胞的制备

11、将免疫成功的小鼠拉颈处死，取出脾脏充分研磨，释放单个脾细胞。滤网过滤除去脾脏组织碎片和杂质，1400rpm离心3分钟，收集沉淀的脾脏细胞。用10ml红细胞裂解液重悬混匀脾脏细胞，静置反应10分钟，再加入15ml md6培养基终止红细胞裂解，离心后弃去液体。再用md6培养基重悬脾脏细胞，并调整细胞浓度至108个/ml。将预先培养好的黑色素瘤细胞重悬为2×107个/ml，将脾脏细胞与黑色素瘤细胞以5：1的比例制备成细胞混合液，离心去液后收集沉淀的细胞。加入1.2ml peg溶液，轻轻混匀后反应1分钟融合细胞。再加入5ml md6培养基终止反应，并离心去除溶液。加入10ml hat培养基重悬细胞，以100μl/孔均匀铺板于96孔培养板中。培养一周后观察杂交瘤细胞的生长情况。

12、2.3阳性杂交瘤细胞筛查

13、在96孔板中挑选出观察有杂交瘤细胞生长(部分孔中细胞死亡)的培养基，对应各孔分别编号，并以直接elisa法测定培养基中akr1b10抗体效价。

14、2.4单克隆阳性杂交瘤细胞筛查

15、将上述阳性杂交瘤孔中的细胞重悬，稀释调整细胞浓度至10个/ml。在96孔板中，以100μl每孔(每孔1个细胞)均匀铺板50个孔。培养一周后观察单克隆阳性杂交瘤细胞的生长情况。挑选出观察有单克隆阳性杂交瘤细胞生长(部分孔中无细胞或细胞死亡)的培养基，对应各孔分别编号，并以直接elisa法测定培养基中akr1b10抗体效价。

16、2.5鼠抗akr1b10单克隆抗体特异性检测

17、以0.1μg/ml浓度的akr1b1抗原包被酶标板，用单克隆阳性杂交瘤细胞上清液检测鼠抗akr1b10单克隆抗体与akr1b1抗原的免疫结合能力(抗体特异性)。

18、6～8周龄的balb/c各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；对免疫动物进行采血，对免疫动物的血清免疫效价和免疫抑制能力进行筛选，已经免疫的小鼠在无菌条件下去除脾脏，完成脾淋巴细胞的制备，通过聚乙二醇(peg4000)法，使小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过hat培养基培养，利用间接elisa检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争elisa法测定阳性细胞孔的抑制效果，获得的两株免疫反应效价最高的单克隆杂交瘤细胞株。

19、3.本发明提供了一种检测akr1b10蛋白浓度的醛酮还原酶1b10测定试剂盒(磁微粒化学发光法)，主要用于胃肠道疾病的筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测。

20、4.项3中所述试剂盒包括：akr1b10校准品、akr1b10质控品、链酶亲和素磁珠溶液、生物素标记抗体、吖啶酯标记抗体。

21、5.项3和4中所述试剂盒中：

22、a)所述生物素标记抗体为生物素标记的鼠抗akr1b10单克隆抗体，作为试剂盒的捕获抗体，特异性的识别akr1b10抗原；

23、b)所述吖啶酯标记抗体为吖啶酯标记的鼠抗akr1b10单克隆抗体，作为试剂盒的检测抗体，可特异性的识别akr1b10抗原；

24、c)所述akr1b10校准品和akr1b10质控品为akr1b10抗原以一定浓度溶解于稀释缓冲液中配制而成；

25、d)链酶亲和素磁珠购于日本株氏会社，以一定的浓度溶解于稀释缓冲液中配制而成。

26、所述试剂盒还包括：

27、预激发液，是将0.05m hno3和0.65％ h2o2溶于纯化水中，ph值为1.21；激发液，是将0.25m naoh溶于纯化水中，ph值为13.31。

28、浓缩清洗液：是将50mm tris-hcl，21％氯化钠和2.5％ tween20溶于纯化水中，ph值为7.8。

29、6.本发明还提供检测akr1b10蛋白的方式，其包括：免疫印迹法、免疫组织化学、酶联免疫法、免疫层析法、免疫比浊法、时间分辨免疫荧光法和磁微粒化学发光法；检测akr1b10蛋白的样本选自胃肠道表皮粘膜组织、胃液、肠液、粪便。

30、本发明的方法中未详细描述的操作步骤也可以参照所属领域的常规操作进行。例如，免疫印迹法和免疫组织化学等检测方式，可参照实验室的常规检测方式；在检测前可将各试剂组分放置室温(18～25℃)平衡，加样前充分混匀等；所用仪器设备，如化学发光测定仪的使用按照说明书操作进行。

31、本发明公开的akr1b10蛋白及其在胃肠道疾病中的应用具有如下优势：

32、1.本发明首次公开了一种胃肠道疾病的新型标志物akr1b10，及其用于胃肠道疾病的筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测；

33、2.本发明公开了检测胃肠道疾病中akr1b10蛋白含量的醛酮还原酶1b10测定试剂盒(磁微粒化学发光法)；

34、3.本发明试剂盒的检测样本可以为胃液、肠液或大便，也可为胃肠道粘膜组织，匀浆后离心取上清，相较于传统检测方式，更加简便，且成本费用低；

35、4.本发明试剂盒以链酶亲和素磁珠为固相载体，吖啶酯为发光物质，具有发光迅速、信号强、本底值低等特点，有利于信号的检测，提高了试剂盒最终的灵敏度和特异性。