一种新鲜植物样品中油菜素甾醇的测定方法

本发明属于植物激素测定，具体涉及一种新鲜植物样品中油菜素甾醇(ebi、ebk、ebd)的测定方法。

背景技术：

1、油菜素甾醇(brs)是一类内源植物生长促进激素，几乎存在于植物的各个部位，影响植物生命周期中的许多生理过程，包括促进细胞伸长和分裂、维管束分化、种子萌发、生根和花粉管形成、光形态建成以及植物结构等，还调节植物对生物和非生物胁迫的反应。但是它们在植物组织中的浓度极低，而且缺乏用于紫外或质谱检测的光敏、电敏或易电离基团，需要通过化学衍生化来提高其电离效率和检测灵敏度，因此brs的分析是一项具有挑战性的工作。

2、已报道的油菜素甾醇测定方法存在仪器设备配置昂贵、合成衍生化试剂、样品前处理过程复杂和灵敏度低等问题。如[xiang-yu wang,cai-feng xiong,tian-tian ye,junding,yu-qi feng.online polymer monolith microextraction with in-situderivatization for sensitive detection of endogenous brassinosteroids by lc-ms.microchemical journal 158(2020):105061；na an,quan-fei zhu,lei yu,yong-tingchen,sheng-li chen,yu-qi feng.derivatization assisted lc-p-mrm-ms with highcid voltage for rapid analysis of brassinosteroids.talanta.217(2020):121058；fei-feng huo,xin wang,ye-hua han,yu bai,wei zhang,han-cheng yuan,hu-wei liu.anew derivatization approach for the rapid and sensitive analysis ofbrassinosteroids by using ultra high performance liquid chromatography-electrospray ionization triple quadrupole mass spectrometry.talanta.,99(2012):420–425.]等。xiang-yu wang等研究的“在线富集与原位衍生技术”需要配备原位衍生和在线富集等昂贵的仪器设备，还需要自制在线富集柱；na an等研究的方法需要合成衍生化试剂(rhodamine b-boronic acid：rhb-ba)；fei-feng huo等研究的方法需要比较大的样品量(2g)和复杂的前处理。特别是大多数已报道的方法在样品验证时，发现测定得到的brs的含量极低、甚至检测不到。而本发明只需要简单易操作的前处理步骤结合市场上现有衍生化试剂衍生化，通过普通的液相色谱-三重四极杆质谱仪就可以精确检测出整株植物不同部位的brs含量。

技术实现思路

1、本发明提供了一种新鲜植物样品中油菜素甾醇(ebi、ebk、ebd)的测定方法。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：

3、一种新鲜植物样品中油菜素甾醇的测定方法，包括如下步骤：

4、(1)取研磨好的新鲜植物样品，加入油菜素甾醇同位素内标，然后加入溶剂提取液超声混匀、旋涡振荡，得到油菜素甾醇提取液，并冷冻离心浓缩至干，得第一油菜素甾醇提取物；

5、(2)对步骤(1)所得第一油菜素甾醇提取物使用第一复溶剂复溶后，通过固相萃取柱除杂，甲醇洗脱，收集洗脱液，冷冻离心浓缩至干，得第二油菜素甾醇提取物；

6、(3)将步骤(2)第二油菜素甾醇提取物使用第二复溶剂复溶，并加入衍生化试剂超声反应2h，得到油菜素甾醇待测溶液，从而实现植物样品中油菜素甾醇的前处理；

7、(4)将步骤(3)所得的油菜素甾醇待测溶液高速离心，通过液相色谱-三重四极杆质谱仪进行检测；

8、进一步地，所述步骤(4)中，色谱条件为：色谱柱为岛津shim-pack xr-odsⅰ2.0mmi.d.×75mm,2.2μm c18柱，流动相a为0.1％的甲酸水溶液，流动相b为甲醇；柱温为40℃；流速为0.25ml·min-1；进样体积为5μl。质谱条件为：电喷雾电离源，扫描方式为正离子扫描，检测方式为多反应监测；

9、进一步地，所述步骤(1)中的新鲜植物样品重量为100mg，所述溶剂提取液为100％的甲醇，所述新鲜植物样品与所述溶剂提取液的质量比为10:1；

10、进一步地，所述步骤(1)中的油菜素甾醇同位素内标为d-bi([2h3]brassinolide)和d-cs([2h3]castasterone)各8ng；

11、进一步地，所述步骤(2)中使用的复溶剂为50％的甲醇，体积为300μl；所述固相萃取柱为watersvac 1cc(100mg)c18柱；进一步地，所述步骤(3)中的复溶剂为乙腈，体积为40μl；

12、进一步地，所述步骤(3)中的衍生化试剂为2mg·ml-1的4-n,n-二甲氨基苯硼酸(dmapba)；

13、进一步地，所述步骤(4)中离心力为15000g；

14、进一步地，所述步骤(4)中色谱条件为：色谱柱为岛津shim-pack xr-odsⅰ2.0mmi.d.×75mm,2.2μm c18柱；流动相a为0.1％的甲酸水溶液，流动相b为甲醇；柱温为40℃；流速为0.25ml·min-1；进样体积为5μl。

15、进一步地，所述步骤(4)中质谱条件为：dl温度为200℃，heat block温度为400℃，nebulizing gas流速为2.5l·min-1，drying gas流速为12l·min-1；毛细管电压为4.5kv。

16、所述新鲜植物样品可以是油菜各部位，且需要在液氮中研磨成粉末状或在冰甲醇中研磨成匀浆。

17、步骤(2)优选地步骤为：首先除去步骤(1)所得油菜素甾醇提取液中的溶剂，用50％甲醇复溶后通过固相萃取柱除杂，油菜素甾醇洗脱溶液冷冻离心浓缩至干，然后用乙腈复溶，加入衍生化试剂进行衍生化反应，即为油菜素甾醇的待测溶液。

18、本发明在上述前处理方法的基础上还提供了一种新鲜植物样品中油菜素甾醇的定量检测方法；将通过该前处理方法所得的植物样品中的油菜素甾醇样品溶液，通过分析仪器采集信号，采用内标法定量，从而得到样品中的油菜素甾醇含量。

19、按照上述方案，分析仪器可以是液相色谱仪、液相色谱-质谱联用仪等。优选地，采用超高效液相色谱-电喷雾离子源-三重四级杆质谱联用仪。

20、具体地，一种新鲜植物样品中油菜素甾醇的液相色谱-三重四极杆质谱测定方法，具体操作步骤如下：

21、(1)精确称取ebi、ebk、ebd、d-bi、d-cs标准品用适量乙腈溶解，均配制成浓度为1000μg·ml-1的标准母液，然后各取适量配制成5μg·ml-1的单标溶液，溶剂为乙腈，放置于-20℃冰箱中密封保存备用；

22、(2)步骤(1)中ebi英文名：epibrassinolide，分子式：c28h48o6，分子量:480.69，cas编号：78821-43-9；ebk英文名：epicastasterone，分子式：c28h48o5，分子量464.69，cas编号：72050-71-6；ebd英文名：6-deoxo-24-epicastasterone，分子式：c28h50o4，分子量：450.71，cas编号：169869-41-4；d-bi英文名：[2h3]brassinolide，分子式：c28h452h3o6，分子量483.71，cas编号：461670-12-2；d-cs英文名：[2h3]castasterone，分子式：c28h452h3o5，分子量467.71，cas编号：461670-13-3。

23、(3)从步骤(1)取适量单标溶液混合，配制成分别含有浓度为300ng·ml-1的ebi、ebk、ebd和20ng·ml-1的同位素内标d-bi和d-cs混合标样溶液，以及含有浓度为20ng·ml-1的同位素内标d-bi和d-cs混合内标溶液，溶剂为乙腈，放置于-20℃冰箱中密封保存备用；

24、(4)准确称取4-n,n-二甲氨基苯硼酸(dmapba)，用乙腈溶解，超声波充分振荡均匀，配制成2.0mg.ml-1的dmapba乙腈溶液，现配现用。

25、(5)取步骤(1)中5μg·ml-1的ebi、ebk、ebd、d-bi、d-cs单标溶液和步骤(3)中的混合标样和混合内标溶液，分别加入步骤(4)配制的2.0mg.ml-1的dmapba乙腈溶液，体积比为2:1，超声振荡2h，超声波温度设置为40℃，得到含有衍生物ebi-dmapba、ebk-dmapba、ebd-dmapba、d-bi-dmapba、d-cs-dmapba的单标溶液以及混合标样和混合内标溶液；

26、(6)取步骤(5)中的混合标样溶液，用混合内标溶液稀释，配制成ebi-dmapba、ebk-dmapba、ebd-dmapba浓度分别为100、50、25、12.5、5、2.5、1ng·ml-1，同时含有d-bi-dmapba、d-cs-dmapba浓度均为13.33ng·ml-1；

27、(7)取步骤(5)中衍生化后的5μg·ml-1的单标溶液ebi-dmapba、ebk-dmapba、ebd-dmapba、d-bi-dmapba、d-cs-dmapba分别进质谱做全扫描，得到其母离子，再通过仪器方法优化确定母离子和子离子的质荷比(m/z)和质谱参数，然后建立其mrm方法，并通过进样逐步优化离子源参数；

28、(8)接上色谱柱，设定好色谱和质谱条件，待仪器稳定后，取步骤(6)的不同浓度标准溶液通过液相色谱-三重四极杆质谱仪(hplc-ms/ms)分析，得到色谱图，然后积分得到不同浓度标样的色谱峰面积，对不同浓度标准溶液的标样与对应的同位素内标的色谱峰面积比值作线性回归，制得标准曲线(图6)，并得到相应的回归方程和相关系数：ebi-dmapba为y＝0.066536x-0.0299944，相关系数为0.99981；ebk-dmapba为y＝0.22528x-0.153636，相关系数为0.99968；ebd-dmapba为y＝0.000233438x-0.000353348，相关系数为0.99989；

29、(9)在植物样品中加入内标d-bi和d-cs各8ng，然后用乙腈提取得到样品溶液；

30、将步骤(8)所述的样品溶液浓缩至干，用50％的甲醇复溶后，过固相萃取柱除杂，用甲醇洗脱，收集洗脱液通过冷冻离心浓缩至干；

31、(10)将步骤(9)所述的样品用乙腈复溶，加入步骤(3)配制的2.0mg.ml-1的dmapba溶液，体积比为2:1，超声振荡2h，超声波温度设置为40℃，进而得到植物样品中油菜素甾醇的待测溶液；

32、(11)将步骤(10)所述的待测溶液通过液相色谱-三重四极杆质谱仪检测分析采集色谱图，将对应的色谱峰进行积分，通过步骤(7)所得标准曲线进行定量，从而得到样品中油菜素甾醇的含量。

33、本发明的有益效果包括：

34、本发明只需要将提取后的样品通过固相萃取柱除杂和dmapba衍生化，就能准确测定植物各部位中油菜素甾醇含量，方法简单、准确、易操作。