一种棉花愈伤细胞自噬活性可视化检测技术

本发明涉及一种棉花愈伤细胞自噬活性可视化检测技术，属于生物染色领域。

背景技术：

1、在营养缺乏或应激条件下，真核生物通过自噬途径将细胞内失活的蛋白质、受损伤的细胞结构和细胞器等实现循环再利用。自噬是真核生物细胞内重要的物质循环利用途径，该过程首先是将回收的物质包裹于膜内，继而运输到溶酶体、液泡中进行降解，或是被分泌到胞外，为细胞的重建、再生和修复提供必需原料。自噬诱发的关键环节是自噬小体的形成，典型的自噬小体是由膜(大部分表现为双层膜，有时会有多层或单层膜)包裹部分胞质、需降解的细胞器(如线粒体、内质网、核糖体)、蛋白质等形成封闭、圆球形的结构，直径约为0.5～1.5μm。在过去数十年里，基于自噬小体的形态发生来检测自噬过程的研究取得了重大进展，已在多种生物诸如酵母、果蝇、老鼠、人类体内观察到了自噬小体的超微结构。有趣的是，近年研究发现植物体细胞胚胎发生过程中也存在复杂的自噬现象，但由于愈伤细胞高度液泡化、结构松散且容易破碎等特点，使植物体细胞胚胎发生过程中的自噬活性检测相对困难。

2、丹酰尸胺(dansylcadaverine,mdc)作为一种嗜酸性染色剂，可通过离子捕获(iontrapping)及其与膜脂的特异性结合，从而特异性标记自噬小体(autophagosome)。正是由于这一特性，mdc通常被用于自噬小体检测的指示剂，其检测激发滤光片波长355～380nm，阻断滤光片波长512～530nm。传统方法先使用雷帕霉素(rapamycin)或氯喹(chloroquine)进行饥饿处理诱导自噬，再用蒸馏水稀释mdc母液制备工作液，对细胞进行染色。但存在诱导成本高、染色液寿命短、对环境敏感，染色结果不稳定，不易捕捉荧光染色结果等缺陷。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种棉花愈伤细胞自噬活性可视化检测技术。与传统的mdc染色法相比较，本发明有以下优点：通过前处理诱导增加细胞自噬水平，显著提高荧光染色强度，提高特异染色的自噬小体与背景的对比度，使细胞内自噬情况更容易被观察到；同时前处理缓冲液具有维持渗透压、保持液体环境ph稳定以及提供基本营养的作用，能显著提高染色的稳定性；染色液配制方便，染色步骤简洁，染色后荧光淬灭缓慢，便于观察拍照。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案是：一种棉花愈伤细胞自噬活性可视化检测技术，包括以下步骤：

3、(1)取同一时期的待检测愈伤组织样品，洗涤，然后加入前处理缓冲液浸没样品，孵育诱导细胞自噬发生；

4、(2)弃去前处理缓冲液，加入pbs缓冲液，过渡；

5、(3)弃去pbs缓冲液，加入mdc染色液浸没样品，染色；

6、(4)弃去mdc染色液，洗涤；再加入pbs缓冲液，吹打分散，得到愈伤细胞悬液；

7、(5)制作愈伤细胞临时装片，利用荧光显微镜观察绿色荧光，分析愈伤细胞自噬活性。

8、进一步，每升pbs缓冲液的配制方法为：将8g nacl、0.2g kcl、1.44g na2hpo4和0.24g kh2po4，溶于800ml蒸馏水中，用hcl溶液调节ph值至7.4，最后加蒸馏水定容至1l。

9、进一步，前处理缓冲液包括以下浓度的组分：234.48mm nacl、10.66mm kcl、52.38mm nahco3、2.02mm nah2po4、11.12mm d-glucose。

10、进一步，mdc染色液的配制方法为：取适量mdc母液(1000x)，按照1:1000的体积比用pbs缓冲液稀释，得到mdc染色液(1x)。

11、进一步，步骤(1)中孵育温度为37℃，时间为30～60min。

12、进一步，步骤(2)中过渡温度为37℃，时间为10min。

13、进一步，步骤(3)中染色条件为37℃避光染色30～60min。

14、进一步，洗涤所用试剂为pbs缓冲液。

15、有益效果：

16、正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此需使用自噬诱导剂对自噬进行人工干预和调节。本发明前处理缓冲液属于细胞分离或培养中常用的磷酸盐缓冲液，主要成分为葡萄糖、nahco3、nacl、kcl，具有维持盐平衡、调节ph以及维持生物活性物质的作用，还可以诱导自噬发生，且操作简单，成本低。同时，前处理缓冲液中的k+和na+能够调节渗透性和张力，保持细胞膜和内部结构的完整性，不易破坏细胞的结构及生物特性。mdc染色之前，用前处理缓冲液处理样品，能提高染色的强度。

17、此外，本发明使用pbs缓冲液洗涤可以避免染色过度，降低背景杂乱程度。使用pbs缓冲液重悬可以避免细胞过度拥挤，有利于自噬现象的观察及后续的量化。使用pbs缓冲液作为溶剂，具有盐平衡、可调整的适宜ph缓冲作用，能溶解并保护试剂。本发明染色步骤更加简洁，染色层次分明，细胞对比度清晰，使植物体细胞胚胎发生过程中的自噬现象高效可视化。

技术特征：

1.一种棉花愈伤细胞自噬活性可视化检测技术，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的棉花愈伤细胞自噬活性可视化检测技术，其特征在于，每升pbs缓冲液的配制方法为：将8g nacl、0.2g kcl、1.44g na2hpo4和0.24g kh2po4，溶于800ml蒸馏水中，用hcl溶液调节ph值至7.4，最后加蒸馏水定容至1l。

3.根据权利要求1所述的棉花愈伤细胞自噬活性可视化检测技术，其特征在于，前处理缓冲液包括以下浓度的组分：234.48mm nacl、10.66mm kcl、52.38mm nahco3、2.02mmnah2po4、11.12mm d-glucose。

4.根据权利要求1所述的棉花愈伤细胞自噬活性可视化检测技术，其特征在于，mdc染色液的配制方法为：取适量mdc母液(1000x)，按照1:1000的体积比用pbs缓冲液稀释，得到mdc染色液(1x)。

5.根据权利要求1所述的棉花愈伤细胞自噬活性可视化检测技术，其特征在于，步骤(1)中孵育温度为37℃，时间为30～60min。

6.根据权利要求1所述的棉花愈伤细胞自噬活性可视化检测技术，其特征在于，步骤(2)中过渡温度为37℃，时间为10min。

7.根据权利要求1所述的棉花愈伤细胞自噬活性可视化检测技术，其特征在于，步骤(3)中染色条件为37℃避光染色30～60min。

8.根据权利要求1所述的棉花愈伤细胞自噬活性可视化检测技术，其特征在于，洗涤所用试剂为pbs缓冲液。

技术总结
本发明公开了一种棉花愈伤细胞自噬活性可视化检测技术，先采用前处理缓冲液对愈伤组织进行孵育，再用PBS缓冲液过渡后，采用MDC染色液进行染色，制备细胞悬液，观察。本发明通过前处理诱导增加细胞自噬水平，显著提高荧光染色强度，提高特异染色的自噬小体与背景的对比度，使细胞内自噬情况更容易被观察到；同时前处理缓冲液具有维持渗透压、保持液体环境pH稳定以及提供基本营养的作用，能显著提高染色的稳定性。本发明使用PBS缓冲液洗涤可以避免染色过度，降低背景杂乱程度。本发明染色步骤更加简洁，染色层次分明，细胞对比度清晰，使植物体细胞胚胎发生过程中的自噬现象高效可视化。

技术研发人员：袁佳辰,刘醒醒,葛晓阳,王少龙
受保护的技术使用者：郑州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12