用于土壤环境中微塑料的高效分离提取方法

本发明涉及土壤环境中微塑料的高效分离提取方法，属于环境污染物分析检测。

背景技术：

1、土壤作为农业生产的基础和核心，能够为作物的生长发育提供足够的养料和营养物质，更是保证农业可持续发展的重要自然资源。然而随着现代工业化的发展，土壤污染问题日益严重，其中由于塑料制品的大量生产制造、快速消耗使用、塑料垃圾的回收管理不当以及农膜的大量使用所引起的微塑料污染已成为土壤中的新型污染物。微塑料是指粒径小于5mm的塑料颗粒，因其粒径小、易迁徙、分布广、化学结构稳定、不易降解等特点，可在环境中长时间存在，且极易被生物摄食并沿着食物链富集、传递，对生态环境和人类健康带来难以估计的危害。

2、近年来，由微塑料带来的污染问题已成为全球性关注的热点问题。土壤环境中的微塑料会通过复杂的物理化学作用改变土壤的理化性质和生物功能等，从而严重影响植物的生长。还可通过土壤动物和微生物的摄取而进入食物链中并进一步传递迁移，进而对更广泛的生命体造成不可估量的影响。因此，对土壤中微塑料污染的研究和治理至关重要。

3、研究及治理土壤中微塑料的关键，是将微塑料从复杂的土壤环境中提取出来，然而土壤性质、矿物组成、有机质含量、微塑料类型和物理性质等的不同，均对微塑料的分离提取具有较大的限制。目前已有的土壤中微塑料的分析多是参照水体与沉积物中微塑料的研究方法，尚无统一、成熟的微塑料分离、提取和纯化方法，不同的方法可能导致结果差异，这在一定程度上限制了对微塑料的分析。已有的从土壤中分离微塑料的方法主要有人工分离、静电分离、加压流体萃取及密度浮选分离等。其中最常用到的是密度浮选分离法，土壤环境中检测到的微塑料密度通常为0.8-1.4g·cm-3，自然土壤样品的密度一般为2.6-2.7g·cm-3，密度浮选分离利用两者之间较大的密度差异，将预处理后土壤样品加入各类高密度盐溶液中，使微塑料等密度较小的成分浮在上层，并作进一步分离。不同的盐溶液会有不同的微塑料回收率，要想获得最佳的微塑料回收率则需选择最合适的盐溶液，根据样本性质选择合适密度的浮选液对于杂质与微塑料的分离至关重要。常见的盐溶液如nacl，由于密度较低，只能提取环境中极少部分的低密度聚合物如pp、pe、ps等；各类高密度盐溶液如nai、ki等却因其使用成本高，导致分离样品量不大，限制了该方法的广泛使用。

4、此外，简单的密度分离法并不能很好地将微塑料从复杂土壤环境中提取出来，还需要进行消解纯化来去除有机物。常用各类消解方法的大多耗时较长，且这种长时间的氧化消解会对微塑料本身产生一定的影响。

技术实现思路

1、本发明的主要目的在于，提供一种能对土壤中的微塑科进行有效提取、操作简单、短时高效、微塑科回收率较高、经济实用的用于土壤环境中微塑料的高效分离提取方法，在“密度浮选法+氧化剂氧化消解”的基础上，使用性价比更高的盐溶液与对微塑料颗粒影响较小的杂质消解方法，用于复杂土壤基质中有机质的去除和微塑料的高效分离。

2、为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

3、一种用于土壤环境中微塑料的高效分离提取方法，主要包括步骤如下：

4、步骤一：含微塑料土壤样本的制备：

5、(1)、空白土壤样本获取：采集无塑料污染的干净样土，研磨后过5mm筛网进行初步粒径筛分，在体视镜下观察其中无微塑料污染后,分别称取10g、100g混合土样备用；

6、(2)、加标微塑料制备：选取聚乙烯pe、聚丙烯pp、聚对苯二甲酸乙二酯pet三类农田土壤环境中最常见的塑料聚合物，密度>1g·cm-3的聚对苯二甲酸乙二酯pet,代表较高密度材料,密度＜1g·cm-3的聚乙烯pe和聚丙烯pp,代表较低密度材料，同时将较高密度材料与较低密度材料,分别做两类微塑料样本,即环境样和标准样；所述的环境样微塑料是由捡拾于长期覆膜农田土壤环境中的残膜、花盆及矿泉水瓶，确定成分后，手工裁剪制得1-2mm大小的塑料样本；所述的标准样微塑料是购得的0.4-0.5mm粒径大小的颗粒状商品微塑料；

7、(3)样本混合：分别称取10g的6个空白土样,称取100g的6个空白土样，在上述12个空白土样中,分别加入100粒的上述pe、pp、pet三个不同种类、上述环境样、标准样两个不同来源的微塑料，充分混合，采用人工扰动的方法使微塑料完全包覆到土壤颗粒中备用；

8、步骤二：微塑料的密度浮选分离：

9、(1)向包覆有微塑料的土样中加入150ml、体积百分比浓度为75％乙醇溶液，室温溶解10-15mins，期间使用玻璃棒充分搅拌2-3次成混合液；

10、(2)将混合液转移至分样筛网，以自来水冲洗土壤，用玻璃棒搅拌过滤；期间用镊子夹取筛网上肉眼可见的大片植物残渣，在自来水下充分清洗后丢弃；筛网上的滤渣用质量百分比浓度为30％的h2o2溶液转移至消解瓶，室温消解1.45-1.55h后补充加入质量百分比浓度为30％的h2o2溶液，消解1.45-1.55h后筛网过滤清洗；

11、(3)所得滤渣用1l的1.45-1.5g·cm-3的zncl2溶液作为浮选液冲洗进干净玻璃瓶，充分搅拌使微塑料悬浮于浮选液中，静置使悬浮液与土壤分层；将悬浮液倒出，过滤悬浮液至滤膜，收集滤膜完成首次浮选；过滤后的底部沉淀中补充加入1l的1.45-1.5g·cm-3的zncl2浮选液二次浮选，过滤并收集滤膜；

12、步骤三、微塑料的消解纯化：利用30％的h2o2溶液作为消解液将两次滤膜上微塑料及少量杂质冲进消解瓶，完成消解纯化，并过滤干净微塑料到滤膜；

13、步骤四、采用体视镜对干燥后的滤膜进行显微观察，计算微塑料的回收率并获取微塑料的形貌特征。

14、作为优选，步骤一(2)中环境微塑料成分的确定，是通过衰减全反射傅里叶变换红外光谱atr-ftir对其聚合物类型进行匹配鉴定,使得所有聚合物的匹配度>80％，从而确定其具体成分。

15、作为优选，步骤二(2)中两次加入的h2o2溶液的质量百分比浓度均为30％，先后加入量分别为50ml、100ml。

16、作为优选，步骤二(2)中所述的分样筛网为600目的标准检验分样筛网。

17、作为优选，步骤二中所述的滤膜孔径为20um。

18、作为优选，步骤三中h2o2消解温度条件为70℃，摇床转速为115rmp，消解时长为9h。

19、作为优选，步骤二(3)中所述的zncl2浮选液为多次回收再利用，回收再利用的做法为：每次使用前加入已知密度的pet聚合物材料对其密度进行测试，最后用1um孔径滤膜过滤后使用。

20、在本发明用于土壤环境中微塑料的高效分离提取方法的研制过程中，申请人主要做了以下工作：

21、1、加标微塑料制备：本发明选取聚乙烯(pe)、聚丙烯(pp)、聚对苯二甲酸乙二酯(pet)这3种农田土壤环境中最常见的聚合物(见表1)，分别代表较高密度(>1g·cm-3)和较低密度(＜1g·cm-3)的材料，同时将其分为环境样和标准样两类.根据这三种基本覆盖了所有常见微塑料从小到大密度范围的标准样来选定最适合的盐溶液，同时考虑到微塑料在长期环境作用下密度可能会发生改变，为提高方法的普适性，同时设置了对应的环境样本，构成了不同的微塑料用于实验。其中环境样微塑料由捡拾于长期覆膜农田土壤环境中的残膜、花盆及矿泉水瓶，确定成分后，手工裁剪，并通过金属筛(1mm)制得1-2mm大小的样本；标准样微塑料是购买于中国广州市中新塑料有限公司的0.4-0.5mm粒径大小的颗粒状微塑料。各类微塑料的信息见表1。

22、表1本方法中所使用的加标微塑料相应的类型、形状、尺寸、来源及密度(g·cm-3)

23、

24、2、zncl2浮选液的密度控制在1.45-1.5g·cm-3的原因：通过前期的实验比较，将zncl2浮选液的密度控制在1.45-1.5g·cm-3，能够很好的实现对各类土壤中常见微塑料(密度：0.8-1.4g·cm-3)的分离，又能避免由于密度过大造成zncl2原材料的浪费以及土壤基质中其他多余干扰物质进入浮选上清液，从而对提取后微塑料的进一步分析鉴定。

25、3、本发明以密度浮选法为基础，对比分析各类浮选试剂的密度、适用性、环境效应及对应试剂的价格，见表2。其中nacl和蒸馏水由于密度太低，并不能提取所有类型的微塑料，只能提取几类微塑料；此外就使用经济性而言，zncl2属于性能最佳的密度分离试剂，故本实验选择zncl2作为浮选试剂，综合考虑回收率以及对环境的副作用，将zncl2作为性能最佳的密度浮选试剂，另外通过zncl2溶液的多次回收利用，极大程度地降低了zncl2的大量使用对环境产生的副作用。

26、表2目前土壤样本分离提取微塑料常用浮选试剂的比较

27、

28、注：表中价格各类试剂的价格来自于麦克林试剂网数据

29、4、长时间的h2o2溶液、fenton试剂的氧化，hno3、hcl等酸溶液和naoh、koh等碱溶液的消解手段在有机质去除时会对微塑料颗粒的完整性产生一定的影响，如表3所示。本发明选择h2o2在70℃下短时(9h)消解来去除植物残渣，极大程度地降低了试剂对于微塑料粒子本身的影响。总体而言，该方法相较于传统分离方法，是一种从复杂土壤基质中提取各类微塑料的简单、高效、低成本且环境效应相对较小的实验方法。

30、表3不同试剂有机质去除方法对比分析

31、

32、本发明的优点在于：

33、本发明能对土壤中的微塑科进行有效提取、工作效率高，是一种回收率较高、经济实用的用于土壤环境中微塑料的高效分离提取实验方法，可以用于复杂土壤基质中有机质的去除和微塑料的高效分离。在“密度浮选法+氧化剂氧化消解”的基础上综合考虑各类盐溶液的密度、使用成本、环境效应及氧化剂对微塑料的影响，合理选择使用性价比更高的盐溶液与对微塑料颗粒影响较小的杂质消解方法，加入各类土壤样本的预处理手段，达到最佳的微塑料提取效果，克服了现有技术土壤中微塑料提取繁琐耗时、效率低下、回收率低的缺陷。

34、(1)本发明提供了一种用于土壤环境中微塑料的高效分离提取实验方法，与现有传统的实验方案相比，本发明通过对土样的无水乙醇溶解、筛网清洗及大尺寸干扰残渣去除等前处理步骤极大地优化了传统的密度浮选分离法，以zncl2溶液的两次浮选，实现12h的浮选在不同量复杂土壤基质(10g、100g)中对于不同源(环境样和标准样)、不同形状(片状、颗粒状)、不同粒径(0.4-0.5mm、1-2mm)微塑料的提取上均获得了87％以上的高回收率，实现了微塑料与复杂基质的高效分离。有研究提出污垢和生物膜可能会改变部分老化微塑料的提取效率，在本方法中，前期的无水乙醇溶解、筛网清洗等步骤有效地去解决了这一问题，且大大缩短了后期的浮选时长。

35、(2)本发明在密度浮选前步骤二第(2)小步加入了两步h2o2短时室温消解的实验步骤的原因：由于常年存在于土壤环境的微塑料孔隙中可能会存在土壤有机质等，从而对微塑料的密度产成一定的影响。故本发明通过室温下短时间的h2o2氧化消解来去除该部分土壤有机质的干扰且不会对微塑料粒子本身产生影响，从而避免后期密度浮选时的微塑料损失。

36、(3)本发明将zncl2浮选液的密度控制在1.45-1.5g·cm-3相当高效的提取了土壤中的微塑料，减少zncl2用量的同时，也使得后续的消解纯化步骤简单高效化。减少微塑料的分离提取成本的同时简化了整体的提取步骤，大大缩短了实验时长。此外，相比于单次长时间浮选，本发明设置了两次密度浮选，第二次密度浮选主要针对第一次过滤时沾黏在容器壁上未回收到的微塑料，同时每次取2/3的浮选上清液过滤，起到充分冲刷容器壁的作用，极大程度地减少了由微塑料本身的沾黏特性而造成的损失。

37、(4)本发明选择在盐溶液分离提取后再进行植物残渣的消解，通过30％的h2o2在70℃，115rmp条件下完成对浮选后残留轻质有机物的高效去除。与目前常见的有机物去除方法相比，本氧化消解手段对于复杂的土壤基质有极好地适用性(各类微塑料回收率＞87％)，且通过消解前步骤的优化处理将消解时长控制在9h，避免长时间氧化消解破坏部分微塑料。

38、(5)本发明是一种短时高效、低成本、工艺简单、环境影响较小的土壤中微塑料分离提取方法，能够实现对5mm-20um粒径范围常见微塑料的有效提取，本发明所述方法可用于环境中各类常见微塑料的分离提取，一次性可处理较大样品量(干重约100g)，提取的微塑料杂质含量低，便于后期微塑性定性定量分析。本发明提出的方法为大量土壤样品中微塑料的检测提供了便利，为土壤中微塑料污染研究提供重要参考。