一种用于猫病毒抗体三联检的检测试剂盒的制作方法

本发明涉及体外诊断，具体的说，涉及一种用于猫病毒抗体三联检的检测试剂盒。

背景技术：

1、随着人们生活水平的提高，越来越多的人喜爱饲养小动物作为自己的宠物，人与动物的密切接触随之而来的是宠物疫病的发病率逐渐增加，特别是一些犬猫宠物源性人畜共患疫病，对人们的身体健康和生命安全构成严重威胁。为了宠物和人类的健康，珍爱生命，科学饲养，保护环境，宠物疫病的防控也显得越来越重要。

2、猫瘟是由猫细小病毒（fpv）引起的，又称猫白细胞减少症、猫传染性肠炎，是猫的一种接触性急性传染病。猫细小病毒是单链dna，是细小病毒科、细小病毒属的一种病毒。临床表现多以突发高热、顽固性呕吐、腹泻、循环障碍以及白细胞急剧减少为主要特征。一年四季均可发生，尤以冬春季多发，可从粪、尿、呕吐物及各种分泌物中大量排出病毒，且病毒在环境中存活时间较长。各年龄的猫均可感染。多数情况下，1岁以下的猫易感，感染率可达70％，死亡率为50-60％，5月龄以下死亡率最高可达80-90％，随年龄的增长，发病率逐渐降低，群养的猫可全群爆发或者全窝发病。

3、猫杯状病毒（felinecalicivirus, fcv）在分类上属杯状病毒科，杯状病毒属，核酸型为单股rna。fcv具有高度的传染性，但在自然条件下，仅猫科动物才会感染fcv。主要表现为上呼吸道症状，即精神沉郁、浆液性和粘液性鼻漏、结膜炎、口腔炎、气管炎、支气管炎，伴有双相热。猫杯状病毒感染是猫的多发病，发病率高，死亡率低，其中死亡率幼猫比成猫高。感染病毒经过治疗后虽然症状可消失，但长期排毒，是最危险的传染源。

4、猫疱疹病毒(fhv-1)是属于大型的病毒（100-130nm直径），具有封套及双股的dna，于细胞核内进行增殖，并形成核内包涵体。病毒会出现于病畜的鼻、眼及喉咙的分泌物中，但大部份是经由鼻子的接触或打喷嚏而传染。自然感染的猫疱疹病毒引发的免疫只能对抗疾病，但没法阻止感染，也不能终生免疫。所以在复发的时候，是会有临床症状的。疫苗接种虽然不能阻止感染，但能对抗疾病，可以在感染的时候，减轻发病症状。

5、对于猫抗体检测的方法与猫类的大致相同，相对成熟的检测方法有血清学试验，比如血凝试验、血凝抑制试验、琼脂扩散试验等，除此之外，elisa的方法也相对广泛，但是elisa方法的操作相对复杂，而且需要配合酶标仪来判读结果，整体反应时间长，因此不适用于基层的快速诊断的需求。另外大多数的试剂是需要2-8℃冷藏贮存，需要冷链运输，增加运输成本。再者，目前的检测都是每种病毒分别检测，检测程序长。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种用于猫病毒抗体三联检的检测试剂盒及其制备方法，通过在硝酸纤维素膜上同时包被猫杯状病毒、猫瘟病毒、猫疱疹病毒相关抗原、羊抗鼠抗体四个条带，并采用酶标记spa抗体，应用免疫渗滤法原理检测猫血清中的猫杯状病毒、猫瘟病毒、猫疱疹病毒免疫抗体，实现快速检测、室温储存的目的，克服了现有检测技术操作复杂、繁琐、无法用全血检测、检测时间长、需要仪器、需要冷链运输的不足。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种用于猫病毒抗体三联检的检测试剂盒，包括检测卡和酶标spa抗体溶液，检测卡包括试纸条，试纸条包括吸水垫，吸水垫上设有硝酸纤维素膜，所述酶是辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶或纳米酶。

3、作为一种优化方案，所述辣根过氧化物酶标spa抗体溶液的制备方法包括如下步骤：

4、（1）预先将辣根过氧化物酶按照5mg/ml溶于超纯水中得到辣根过氧化物酶溶液，将高碘酸钠溶液8mg/ml加入辣根过氧化物酶溶液中，室温下避光轻搅50min，用ph4.4的醋酸盐缓冲液0.1m透析24h，期间换液3次；

5、（2）加入0.1m的碳酸盐缓冲液；

6、（3）加入10mg/ml的spa抗体，辣根过氧化物酶与spa抗体的质量比为2:1，室温下避光轻轻搅动3h；

7、（4）加入4mg/ml的硼氢化钠溶液，室温反应4h，观察反应液中无气泡溢出；

8、（5）用ph7.4的pbs缓冲液透析24h，期间换液3次，得到辣根过氧化物酶标spa抗体；

9、（6）按照使用比例将辣根过氧化物酶标spa抗体用辣根过氧化物酶标spa抗体稀释液稀释后得辣根过氧化物酶标spa抗体溶液。

10、作为一种优化方案，所述碱性磷酸酶标spa抗体溶液的制备方法包括如下步骤：

11、（1）预先将碱性磷酸酶按照5mg/ml溶于超纯水中得到碱性磷酸酶溶液，加入5mg/ml的spa抗体，碱性磷酸酶与spa抗体的质量比为2:1，室温下避光反应5h，之后用ph7.4的pbs缓冲液透析24h，期间换液3次；

12、（2）加入40ul 25%的戊二醛溶液，4℃反应15h；

13、（3）用ph7.4的pbs缓冲液透析24h，期间换液3次，得到碱性磷酸酶标spa抗体；

14、（4）按照使用比例将碱性磷酸酶标spa抗体用碱性磷酸酶标spa抗体稀释液稀释后得碱性磷酸酶标spa抗体溶液。

15、作为一种优化方案，所述纳米酶标spa抗体溶液的制备方法包括如下步骤：

16、（1）将3mg edc和3mg nhs涡旋溶解于1ml去离子水中，加入3mg纳米酶，在室温下孵育30min，收集功能化的纳米酶，用超纯水洗涤两次；

17、（2）收集沉淀，加入50mm ph6.0 naac缓冲液，然后加入1mg/ml spa抗体，将混合物涡旋混匀，在4℃下孵化24h；

18、（3）用0.1m ph7.4的pbs缓冲液洗涤两次，得到纳米酶标记spa抗体；

19、（4）再次用0.1m ph7.4的pbs缓冲液洗涤，然后分散到1ml纳米酶标spa抗体稀释液中得纳米酶标spa抗体溶液。

20、作为一种优化方案，所述辣根过氧化物酶标spa抗体稀释液包括20mm pbs缓冲液、0.15%bsa、0.5%海藻糖、0.12%pvp和0.1%proclin-300。

21、作为一种优化方案，所述碱性磷酸酶标spa抗体稀释液包括20mm tbs缓冲液、0.1%bsa、0.5%海藻糖、0.05%pva和0.1%proclin-300。

22、作为一种优化方案，所述纳米酶标spa抗体稀释液包括20mm pbs缓冲液、3%bsa、1%蔗糖、0.1%peg和0.1%proclin-300。

23、作为一种优化方案，所述所述检测卡包括上盖、下盖，上盖上设有观察窗和检测孔。

24、作为一种优化方案，检测卡的制备方法包括如下步骤：

25、（1）硝酸纤维素膜的制备：在硝酸纤维素膜上依次包被猫瘟病毒抗原、猫杯状病毒抗原、猫疱疹病毒抗原和羊抗鼠抗体作为检测t1线、检测t2线和检测t3线和质控c线，猫瘟病毒抗原的浓度为0.5mg/ml，猫杯状病毒抗原的浓度为0.6mg/ml，猫疱疹病毒抗原的浓度为0.4mg/ml，羊抗鼠抗体的浓度为2mg/ml；

26、（2）吸水垫的制备：

27、将滤纸或卫生纸裁成2*2cm大小的小块，取6块装订在一起；

28、（3）检测卡的组装

29、先将吸水垫放于下盖的中间位置，然后将裁切好的硝酸纤维素膜放于吸水垫的正中间，将上盖对准硝酸纤维素膜按下密封。

30、作为一种优化方案，一种用于猫病毒抗体三联检的检测试剂盒，还包括样本稀释液，样本稀释液包括50mm pbs、0.15m sds、0.4%吐温、0.15% s21、0.01%曲拉通405、0.03%bsa和0.1%proclin-300。

31、本发明采取以上技术方案，具有以下优点：

32、1、可同时检测猫瘟病毒、猫杯状病毒、猫疱疹病毒相关抗原的免疫抗体，减少了检测的程序，方便、快速、简捷；

33、2、可以使用全血，不需要昂贵的仪器设备、操作熟练的技术人员、较长的检测时间；

34、3、可常温保存12个月以上，适合在基层推广，不受样本量多少和种类的影响，适用于基层大批量检测，可应用于疫苗免疫效果的评估与检测，对预防和控制病毒的感染具有重要意义；

35、4、标记物是酶标spa抗体，应用于渗滤法上比层析法判读结果更快速；

36、5、检测准确率高。

37、下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。