一种低分子肝素的结构解析的方法与流程

本技术属于糖分析，具体地，涉及一种低分子肝素的结构解析的方法。

背景技术：

1、肝素类药物是一种历史悠久的抗凝血和抗血栓类药物，包括未分级肝素、低分子肝素和超低分子肝素，主要用于心脑血管疾病和体外透析治疗。近年来，肝素类药物的抗炎症、抗肿瘤等其他药物活性也逐渐引发了人们的重视，应用前景广阔。肝素是一种高度磺酸化的动物源多糖混合物，葡萄糖醛酸/艾杜糖醛酸---氨基葡萄糖组成的双糖单元连续排列形成了肝素的骨架结构。葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸的2-o、氨基葡萄糖的3、6-o与n位可能发生磺酸取代；氨基葡萄糖的n还可能发生乙酰基取代(参见图1)。

2、肝素的构成组分极为复杂、分子量分布范围广，其中各组分的精细结构及含量决定了其药物活性。尽管已应用于临床近百年，其精确表征与质量控制仍然面临极大挑战。因此，针对肝素类药物的结构特点建立完善的表征方法与质控体系对该类药物的安全性提升至关重要。

3、糖链指纹图谱分析是表征糖链结构的重要手段，而目前针对肝素多糖的指纹图谱解析受限于色谱的分离能力。指纹图谱分析过程中常采用亲水色谱(hilic)对糖链进行分离。由于hilic分离需要的流动相中盐浓度不高，可以和高分辨质谱进行联用(hilic-ms)，将肝素糖链按照长短和极性进行一定程度的分离。然而，受限于分离原理，hilic色谱柱在大多数情况下无法实现糖链混合物中同分异构体的有效分离。以依诺肝素的分离为例，依诺肝素是目前临床上使用最为广泛的一种低分子肝素，是未分级肝素经苄酯化反应与β-消除降解后得到的低分子肝素(参见图2)

4、采用hilic-ms进行依诺肝素全糖链图谱分析时，通常在总粒子流图(tic)的基础上提取特定m/z，得到提取离子流图(eic)，参见图3。例如m/z＝516.6561[1,2,3,0,7,1]结构括号中的数字分别依次代表不饱和己糖醛酸、饱和己糖醛酸、氨基葡萄糖、乙酰基、磺酸基以及末端1,6脱水结构的数目。从eic谱图来看，提取该m/z仅得到一个色谱峰。然而，从肝素糖链的结构特点可知，该结构中可能发生磺酸化修饰的位点有11个，且位于糖链中间的己糖醛酸可能存在葡萄糖醛酸与艾杜糖醛酸两种不同的构象。因此，该色谱峰可能对应多个同分异构体，由于hilic-ms方法的分辨力较差，无法实现各同分异构体的有效分离，导致糖链结构表征不清楚，影响药物的安全性、有效性评价。

技术实现思路

1、基于上述现有技术中存在的问题，本技术提供了一种低分子肝素的结构解析的方法。

2、具体来说，本技术涉及以下内容：

3、1.一种低分子肝素的糖链结构解析的方法，其中，所述方法包括：

4、对低分子肝素进行液相色谱分离，然后采用四级杆-离子淌度-高分辨质谱联用技术对低分子肝素进行分析。

5、2.根据项1所述的方法，其中，所述低分子量肝素的重均分子量为4000-7000da；优选对低分子肝素的糖链进行结构解析是指对低分子肝素中的8糖以下的糖链的结构进行解析。

6、3.根据项1所述的方法，其中，将液相色谱分离后的样品采用四级杆对8糖以下的寡糖对应的m/z的离子进行初步筛选。

7、4.根据项3所述的方法，其中，所述离子淌度为环形离子淌度，采用环形离子淌度对8糖以下的寡糖对应的m/z的糖链进行分离，

8、优选，在所述环形离子淌度分析中，控制离子在环形淌度池中的分离圈数、每次淌度分析时的离子推动次数以及对在环形淌度池中运动的离子施加的电压，进行所述环形离子淌度分析。

9、5.根据项1所述的方法，其中，所述高分辨质谱为飞行时间质谱仪，优选在利用飞行时间质谱仪进行的分析中，控制离子源相关参数和带电离子在四级杆质谱仪中传输相关参数，进行所述质谱分析。

10、6.根据项1所述的方法，其中，

11、在四级杆中，控制四级杆选择质核比的窗口大小，即控制lm resolution为5-15，优选为5-10，同时控制hm resolution为10-20，优选为10-15；

12、优选，在四级杆中，控制带电离子在四级杆中传输所用的能量，即控制transfer碰撞能为1-12v，优选为1-2v。

13、7.根据项4所述的方法，其中，

14、控制离子在环形淌度池中的分离圈数是通过控制adc延迟时间来实现，即控制adc延迟时间为5n-30n ms，优选为10n-20n ms，其中n为在环形离子淌度中的旋转圈数，n为大于0的整数；和/或

15、控制每次淌度分析时的离子推动次数是将其控制在1-5的范围内，优选控制在1-3的范围内；和/或

16、控制对在环形淌度池中运动的离子施加的电压是通过控制静态行波高度(twstatic height)来实现，即控制静态行波高度为5-30v，优选为10-20v。

17、8.根据项5所述的方法，其中，

18、控制离子源相关参数包括控制毛细管电压以及脱溶剂气的温度；

19、优选控制毛细管电压为1.0-10.0kv，进一步优选为1.5-3.0kv；

20、优选控制脱溶剂气的温度为30-100℃，进一步优选为40-60℃；和/或

21、控制带电离子在四级杆质谱仪中传输相关参数包括控制离子传输相关电压梯度，即控制前端传输电压梯度为0-20v，优选为1-10v。

22、9.根据项1-8中任一项所述的方法，其中，所述液相色谱为亲水性色谱或分子排阻色谱；

23、优选地，所述液相色谱流动相a为挥发性盐的水溶液，流动相b为挥发性盐的乙腈水溶液。

24、10.根据项1-9中任一项所述的方法，其中，控制四级杆的离子能量为1-10v，优选为1-5v；和/或

25、控制四级杆的前过滤电压为1-10v，优选为2-7v；和/或

26、控制四级杆的trap碰撞能为1-10v，优选为1-5v。

27、11.根据项1-10中任一项所述的方法，其中，在高分辨质谱分析中，控制离子源的毛细管电压为1k-10kv，优选为1k-5kv；和/或

28、控制离子传输的身体梯度电压为1-20v，优选为5-15v；和/或

29、控制离子传输的头部梯度电压为1-10v，优选为2-7v；

30、控制离子捕集tw脉冲高度为1-10v，优选为1-5v；和/或

31、控制离子捕集入口电压为1-10v，优选为1-5v；和/或

32、控制离子捕集偏向电压为1-10v，优选为1-5v；和/或

33、控制后端离子捕集偏向电压为5-30v，优选为15-30v；和/或

34、控制射频电压的stepwave射频为100-250v，优选为120-180v；和/或

35、控制射频电压的离子导向(ion guide)射频为100-300v，优选为150-300v；和/或

36、控制射频电压的driftcell射频为100-300v，优选为150-300v；和/或

37、控制射频电压的传输射频增益为1-10，优选为1-5；和/或

38、控制射频电压的离子导向(ion guide)射频ramp为打开状态。

39、12.根据项1-11中任一项所述的方法，其中，在所述离子淌度分析中，控制序列的分离时间为20-40ms，优选为20-30ms。

40、13.一种低分子肝素糖链结构分析谱图，其是利用项1-12中任一项所述的方法对低分子量肝素进行分析得到的。

41、14.四级杆-离子淌度-高分辨质谱联用在低分子肝素糖链分析中的应用。

42、发明的效果

43、本技术所述的方法能够对天然存在的未知结构的肝素进行结构解析。采用本技术所述的方法能够对8糖以下的低分子肝素糖链进行结构解析，从而可以更全面地解析未知结构的肝素。