一种广谱检测丁香酚类物质的比率荧光免疫分析方法

本发明属于荧光分析术领域，具体地是涉及一种基于红色荧光金纳米簇和邻苯二胺广谱检测丁香酚类物质的比率荧光免疫分析方法。

背景技术：

1、丁香酚类化合物，主要包括丁香酚与异丁香酚、甲基丁香酚与甲基异丁香酚、乙酸丁香酚酯与乙酰基异丁香酚3组同分异构体，自20世纪70年代初被发现具有强烈的麻醉作用而被广泛用于动物运输过程。鲜活水产品在流通运输过程中，于暂养水体里添加丁香酚对鲜活水产品进行麻醉，可使其进入类似休眠状态从而降低生理代谢强度，有效降低鱼体损伤率和死亡率，从而增加经济效益。但研究表明丁香酚可能造成哺乳动物肝脏损伤，甚至具有潜在的致癌作用。美国国家毒理学计划(ntp)通过对丁香酚类化合物的毒理作用进行研究表明，啮齿动物食用丁香酚后在一段时间内能导致其机体产生癌细胞或者是是潜在的致癌物；美国食品药品监督管理局(fda)也禁止丁香酚化合物作为活鲜食用水产品的麻醉剂和镇定剂；国际癌症研究机构(iarc)的报告表明，丁香酚可导致小鼠肝细胞癌的发病率增加，并将其列为致癌第三种类型。因此，评估和监测微量麻醉剂对于保护人体健康和控制环境污染是必要的。

2、目前，丁香酚的检测方法主要以仪器检测为主，包括紫外分光光度法、薄层色谱法、毛细管电泳法、气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-串联质谱法、液相色谱-串联质谱法等分析方法。但是这些方法仍存在一些缺陷，比如分光光度法灵敏度低、毛细管电泳法重现性差、色谱法前处理相对复杂存在干扰，无法满足快速检测需求。仪器分析法需要昂贵的检测设备和相对专业的技术人员进行操作，用于基层一线检测受到限制。。

3、基于抗原抗体特异性结合反应的elisa方法具有高通量、灵敏、简便、成本低、操作简单、准确性好等优点，非常适用于现场快速筛查与检测，在食品污染物快速筛查上备受关注。现有的丁香酚免疫分析法相对较少。解超男等(解超男,李芹,韩刚,刘欢,吴立冬,李晋成.基于单克隆抗体的胶体金免疫层析法快速检测丁香酚[j].食品安全质量检测学报,2019,(20):6938-6943)建立了丁香酚的胶体金免疫层析法，方法快速、成本低廉，检出限为2.0mg/l。目前的基于免疫分析方法对丁香酚的检测灵敏度相对较低，且主要是针对丁香酚单一化合物测定，可同时测定6种(3组同分异构体)丁香酚类物质(丁香酚与异丁香酚、甲基丁香酚与甲基异丁香酚、乙酸丁香酚酯与乙酰基异丁香酚)的方法未见报道。而且，传统的elisa对于水产品这种基质较为复杂的样品有着灵敏度不足的缺点，且灵敏度较低。因此，引入荧光材料替代传统elisa的显色剂，将荧光作为信号因子能有效提高检测灵敏度。然而单一荧光信号容易受到操作、环境、仪器等影响而造成较大的误差，细小的差别也会导致荧光信号的巨大改变，不利于样品的痕量检测。为了克服此问题，可以引入两个荧光信号进行比值测定，两个荧光发射峰强度受到的外界干扰基本相同，具有自校准效应，能在一定程度上消除外界干扰因素带来的误差，这样的体系更加适合用于水产品的检测。

4、目前尚未有关于丁香酚类物质的广谱性比率荧光免疫分析方法的报道。

技术实现思路

1、为了弥补现有技术缺陷，本发明目的在于提供一种基于红色荧光金纳米簇和邻苯二胺广谱检测丁香酚类物质的比率荧光免疫分析方法。通过在微孔板中包被丁香酚包被原，以丁香酚单克隆抗体(anti-eug ab)作为识别元件，应用抗原抗体的特异性结合反应，构建竞争反应模式，随后洗去未结合的药物和抗体，再将辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(ab2-hrp)作为信号放大元件，与抗体结合，随后洗去未结合的二抗，连接在微孔板的hrp催化随后加入的h2o2(过氧化氢)和opd(邻苯二胺)氧化生成荧光物质dap(2,3-二氨基吩嗪)，随后再向其中加入红色荧光牛血清蛋白包被的金纳米簇(bsa-au ncs)，生成的dap会猝灭bsa-au ncs的荧光。其中bsa-au ncs的发射波长为670nm，dap的发射波长为570nm。因此，由于药物浓度不同，抗原抗体的竞争反应使得微孔板上连接的hrp数量不同，导致酶催化氧化产生的dap浓度不同，最终没有被猝灭的bsa-au ncs和产生的dap含量不同，最后计算在570nm与670nm波长处的荧光强度比值上，可实现对丁香酚类物质广谱检测的目的。本方法具有方便、操作简单、灵敏度高、检出限低的优势，适用于水产品中6种丁香酚类物质的快速检测，应用前景广阔。

2、本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。

3、一种广谱检测丁香酚类物质的比率荧光免疫分析方法，其包括以下步骤：

4、s1.合成红色荧光牛血清蛋白包被的金纳米簇：将一定浓度的氯金酸溶液与等量牛血清蛋白溶液混合，随后加入适量的氢氧化钠溶液，将溶液ph调至碱性，加热反应过夜，反应完成后得到红色荧光牛血清蛋白包被的金纳米簇水溶液(即bsa-au ncs溶液)，于冰箱避光保存，使用时稀释一定倍数；

5、s2.微孔板的包被：将丁香酚包被原加入微孔板中，在冰箱静置一段时间，随后洗去包被液；将板拍干，加入一定体积封闭液，温育一段时间后，将板拍干，于烘箱中烘干，储存备用；

6、s3.标准曲线的建立：将不同浓度的丁香酚类物质标准溶液与丁香酚单克隆抗体同时加入步骤s2得到的微孔板中，温育一定时间后，洗板，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，温育一段时间后洗板，加入h2o2和opd溶液温育，随后加入步骤s1制备的bsa-au ncs溶液，温育，在360nm激发下，记录400～750nm范围内的荧光发射光谱；计算荧光强度比值f570/f670，以丁香酚类物质浓度为横坐标，f570/f670为纵坐标绘制标准曲线；

7、s4.样品中丁香酚类物质浓度的测定：将等体积处理好的样品替代丁香酚类物质标准品溶液，按照步骤s3的步骤操作，将测到的f570/f670代入所述步骤s3得到的标准曲线，以得到样品中丁香酚类物质浓度。

8、作为本发明提供的广谱检测丁香酚类物质的比率荧光免疫分析方法的一种优选实施方式，所述步骤s1氯金酸溶液的浓度为10～20mm，牛血清蛋白溶液的浓度为50～60mg/ml。

9、作为本发明提供的广谱检测丁香酚类物质的比率荧光免疫分析方法的一种优选实施方式，所述步骤s1中，氯金酸溶液与牛血清蛋白溶液的加热温度为37℃，反应10～14h。

10、作为本发明提供的广谱检测丁香酚类物质的比率荧光免疫分析方法的一种优选实施方式，所述步骤s2中，丁香酚包被原体积100μl，静置12～15h。

11、作为本发明提供的广谱检测丁香酚类物质的比率荧光免疫分析方法的一种优选实施方式，所述步骤s2中，封闭液需100～200μl，封闭1～3h。

12、作为本发明提供的广谱检测丁香酚类物质的比率荧光免疫分析方法的一种优选实施方式，所述步骤s3中，丁香酚单克隆抗体的浓度为1～5μg/l，时间为30～40min。

13、作为本发明提供的广谱检测丁香酚类物质的比率荧光免疫分析方法的一种优选实施方式，所述步骤s3中，h2o2和opd溶液浓度为0.5mm～5mm，时间为30～40min。

14、作为本发明提供的广谱检测丁香酚类物质的比率荧光免疫分析方法的一种优选实施方式，所述丁香酚类物质为丁香酚、异丁香酚、丁香酚甲醚、异丁香酚甲醚、乙酸丁香酚酯、乙酰基异丁香酚。

15、作为本发明提供的广谱检测丁香酚类物质的比率荧光免疫分析方法的一种优选实施方式，该分析方法具体包括以下步骤：

16、s11.红色荧光牛血清蛋白包被的金纳米簇的合成：将10ml的氯金酸溶液(10mm)与10ml牛血清蛋白溶液(50mg/ml)混合，随后加入1ml的氢氧化钠溶液(1m)，将溶液ph调至碱性，37℃加热反应12h，反应完成后得到红色荧光牛血清蛋白包被的金纳米簇水溶液，于4℃冰箱避光保存；

17、s12.96孔微孔板的包被：将100μl丁香酚包被原加入微孔板中，在4℃冰箱包被12h，随后洗去包被液，将板拍干，加入封闭液120μl封闭3h，甩干封闭液，放入37℃中烘干，储存备用；

18、s13.标准曲线的建立：将50μl不同浓度的丁香酚类物质标准溶液与50μl抗体同时加入步骤s12得到的96孔微孔板中，温育40min后，洗板，加入5000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗100μl，温育30min后，洗板，每孔加入1mm的h2o2和1mm的opd溶液各50μl，随后加入步骤s11制备的bsa-au ncs溶液50μl，温育30min，在360nm激发下，记录400～750nm范围内的荧光发射光谱；计算荧光强度比值f570/f670，以丁香酚类物质浓度为横坐标，f570/f670为纵坐标绘制标准曲线；

19、s14.样品中丁香酚类物质浓度的测定：将等体积处理好的样品替代丁香酚类物质标准品溶液，按照步骤s13的步骤操作，将测到的f570/f670代入所述步骤s3得到的标准曲线，以得到样品中丁香酚类物质浓度。

20、与现有技术相比，本发明有益效果在于：

21、通过在微孔板中包被丁香酚包被原，以丁香酚单克隆抗体(anti-eug ab)作为识别元件，应用抗原抗体的特异性结合反应，构建竞争反应模式，随后洗去未结合的药物和抗体，再将辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(ab2-hrp)作为信号放大元件，与抗体结合，随后洗去未结合的二抗，连接在微孔板的hrp催化随后加入的h2o2(过氧化氢)和opd(邻苯二胺)氧化生成荧光物质dap(2,3-二氨基吩嗪)，随后再向其中加入红色荧光牛血清蛋白包被的金纳米簇(bsa-au ncs)，生成的dap会猝灭bsa-au ncs的荧光。其中bsa-au ncs的发射波长为670nm，dap的发射波长为570nm。因此，由于药物浓度不同，抗原抗体的竞争反应使得微孔板上连接的hrp数量不同，导致酶催化氧化产生的dap浓度不同，最终没有被猝灭的bsa-au ncs和产生的dap含量不同，最后计算在570nm与670nm波长处的荧光强度比值上，可实现对丁香酚类物质广谱检测的目的。

22、本发明基于两个荧光材料发射峰荧光强度的比值变化进行免疫分析，由于两个荧光材料受到的外界的干扰是一样的，两者的荧光强度比值一定程度上抵消了温度、极性、荧光团浓度等外界因素的干扰，具有自带内标效应，因此具有更高精密度、信噪比及灵敏度。该方法较传统仪器方法，更为简单快捷，检出限低至0.50pg/ml，可用于测定水产品中丁香酚、异丁香酚、丁香酚甲醚、异丁香酚甲醚、乙酸丁香酚酯、乙酰基异丁香酚6种麻醉剂，应用前景广阔。