一种用于检测NK细胞活性的试剂盒的制作方法

本发明涉及生物检测，具体涉及一种用于检测nk细胞活性的试剂盒。

背景技术：

1、自然杀伤细胞（nk）是一种大颗粒淋巴细胞，能直接杀伤靶细胞的特殊淋巴细胞系，具有抗肿瘤、抗感染及免疫调节的功能。nk细胞是与t、b细胞并列的第3类群淋巴细胞，在外周血中约占淋巴细胞总数的5-25％。nk细胞疗法也是癌症治疗的新兴技术，其治疗关键在于产生数量足够能识别并杀伤肿瘤的免疫细胞，以及效应细胞能够到达肿瘤所在的部位，并在肿瘤周围被激活，而且能够发挥抗肿瘤的作用。除了能够杀伤肿瘤细胞外，还可以替代修补或者改善化疗所引起的免疫功能受损。

2、nk细胞活性的检测对于癌症的早期诊断以及癌症的干预治疗效果评价具有重要的指导意义。其杀伤效应是由其活化后释放出的毒性分子介导，如γ-干扰素 (ifn-γ)和α-肿瘤坏死因子(tnf-α）等。nk细胞杀伤的靶细胞主要是肿瘤细胞、病毒感染细胞、较大的病原体（如真菌和寄生虫）、同种异体移植器官、组织等。它具有广谱抗瘤作用，特别是对淋巴瘤和白血病细胞作用更为明显。目前nk细胞活性检测的方法主要包括形态法、流式细胞仪技术和酶联免疫吸附（elisa）。形态法的方法简便，易于掌握，但判断死细胞与活细胞不免带有检测者的主观因素，也无法计数轻微损伤的细胞。流式细胞设备价格昂贵，操作复杂，结果的准确性与样品的制备息息相关；酶联免疫法法自动化程度不高，检测时间长，且受人为因素影响较大。因此针对上述问题，有必要建立一种检测nk细胞活性的试剂盒。

技术实现思路

1、本发明的目的在于：针对现有技术存在的不足，提供一种用于检测nk细胞活性的试剂盒，该试剂盒操作简单、检测时间短、灵敏度高、线性范围宽、无污染、可以定量检测。

2、为了实现上述发明的目的，本发明的技术方案是：

3、一种用于检测nk细胞活性的试剂盒，所述试剂盒包括检测卡、样本稀释液和激活剂；所述检测卡内部设有试纸条，所述试纸条的结合垫上包被有生物素标记的ifn-γ抗体、生物素标记的tnf-α抗体、荧光微球标记的亲和素以及荧光微球标记的dnp-bsa；所述试纸条的硝酸纤维素膜上设有第一检测线、第二检测线和质控线，所述第一检测线包被有ifn-γ抗体，所述第二检测线包被有tnf-α抗体，所述质控线包被有兔抗dnp抗体；所述激活剂包括人白介素il-2、il-12或两者的组合。

4、作为一种改进的技术方案，所述激活剂的用量为5-10ng/ml。

5、作为一种改进的技术方案，所述样本稀释液为含有0.6wt%-1.8wt%peg800、0.1wt%-1.5wt%nacl、0.75wt%-2wt%pva、0.1wt%-0.5wt%酪蛋白、0.1wt%-1wt%s9的tris缓冲液，且所述tris缓冲液的ph为8.0-8.5，浓度为10-50mm。

6、作为一种改进的技术方案，采用生物素标记ifn-γ抗体和生物素标记tnf-α抗体的方法包括以下步骤：

7、（1）用ph8.0、0.1mol/l碳酸氢钠缓冲液或ph8.6、0.5mol/l硼酸缓冲液将ifn-γ或tnf-α稀释到1mg/ml，继续采用上述碳酸氢钠缓冲液或硼酸缓冲液对稀释后的ifn-γ或tnf-α进行透析，透析后的ifn-γ抗体溶液或tnf-α抗体溶液备用；

8、（2）取步骤（1）中1ml备用的ifn-γ抗体溶液或tnf-α抗体溶液,加入120μl、1mg/ml的nhsb溶液，搅拌保温2-4h后加入9.6μl、1mol/lnh4cl溶液，继续搅拌、透析、过分子筛柱、收集的液体中加入终浓度0.5g/l的叠氮钠、1.0g/lbsa以及甘油，-20℃保存即可。

9、作为一种改进的技术方案，采用荧光微球标记亲和素和荧光微球标记dnp-bsa的方法包括以下步骤：

10、（1）采用ph6.0、50mm mes缓冲液将微球洗涤，离心后继续采用mes缓冲液进行复溶，备用；

11、（2）将微球、edc、sulfo-nhs按照质量比为1:0.1-1:0.1-3的比例活化20-60min，离心，采用步骤（1）中mes缓冲液进行复溶、洗涤、离心，采用ph6.5、50mm mes缓冲液复溶，按照每1mg微球偶联0.1-1mg链酶亲和素或dnp-bsa的用量加入链酶亲和素或dnp-bsa，超声、孵育2-3h，再采用终浓度为100mm甘氨酸猝灭，继续孵育20-30min，采用微球封闭缓冲液洗涤、离心后复溶、封闭2-4h，离心，采用微球保存液进行复溶，4℃保存备用；

12、作为一种改进的技术方案，所述微球封闭缓冲液为含有1-5wt% bsa 和0.05wt%tween-20的pbs缓冲液。

13、作为一种改进的技术方案，所述微球保存液为含有0.01wt%酪蛋白、 0.01wt% 叠氮钠的碳酸钾缓冲液，所述碳酸钾缓冲液的浓度为3mm，ph为8.0-10.0。

14、作为一种改进的技术方案，所述结合垫的制备是将生物素标记的ifn-γ、tnf-α和荧光微球标记的亲和素按体积比1-4:1-4:1的比例分散于微球稀释液中，荧光微球标记的dnp-bsa以2.5%-10%v/v的用量再分散于微球稀释液中，采用定量喷金仪以1-4 μl/cm的喷量包被于处理过的玻璃纤维上，在 37℃鼓风烘干2h后保存备用。

15、作为一种改进的技术方案，所述微球稀释液为含有0.2%v/v吐温20、0.3wt%牛血清白蛋白、0.3%v/v聚乙二醇、5wt%蔗糖、5wt%海藻糖、0.5wt%防腐剂的tris-hcl缓冲液，所述tris-hcl缓冲液的ph为8.0-8.2。

16、作为一种改进的技术方案，所述试纸条的加样垫在制备时采用封闭液处理30min，所述封闭液为含有0.5wt%-3wt%牛血清白蛋白、0.1wt%-0.5wt%酪蛋白、0.1wt%-5wt%pvp、0.02wt%-0.05wt%磷酸二氢钾和0.01wt%-0.1wt% 吐温20的tris缓冲液，所述tris缓冲液的浓度为10-50mm。

17、本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有以下优点：

18、本发明提供的检测nk细胞活性的试剂盒能在一条试纸条上实现对ifn-γ和tnf-α的同步、快速检测，使用的抗体均为单克隆抗体，特异性好、各种细胞因子的检测之间无干扰，简单、快速。本发明的试剂盒采用荧光微球联合生物素-亲和素放大系统，最大程度提高了信号灵敏度，大大提高了试剂盒的特异性和检测结果的准确性。

技术特征：

1.一种用于检测nk细胞活性的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括检测卡、样本稀释液和激活剂；所述检测卡内部设有试纸条，所述试纸条的结合垫上包被有生物素标记的ifn-γ抗体、生物素标记的tnf-α抗体、荧光微球标记的亲和素以及荧光微球标记的dnp-bsa；所述试纸条的硝酸纤维素膜上设有第一检测线、第二检测线和质控线，所述第一检测线包被有ifn-γ抗体，所述第二检测线包被有tnf-α抗体，所述质控线包被有兔抗dnp抗体；所述激活剂包括人白介素il-2、il-12或两者的组合。

2.根据权利要求1所述的一种用于检测nk细胞活性的试剂盒，其特征在于：所述激活剂的用量为5-10ng/ml。

3.根据权利要求1所述的一种用于检测nk细胞活性的试剂盒，其特征在于：所述样本稀释液为含有0.6wt%-1.8wt%peg800、0.1wt%-1.5wt%nacl、0.75wt%-2wt%pva、0.1wt%-0.5wt%酪蛋白、0.1wt%-1wt%s9的tris缓冲液，且所述tris缓冲液的ph为8.0-8.5，浓度为10-50mm。

4.根据权利要求1所述的一种用于检测nk细胞活性的试剂盒，其特征在于：采用生物素标记ifn-γ抗体或tnf-α抗体的方法包括以下步骤：

5.根据权利要求1所述的一种用于检测nk细胞活性的试剂盒，其特征在于：采用荧光微球标记亲和素或dnp-bsa的方法包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的一种用于检测nk细胞活性的试剂盒，其特征在于：所述微球封闭缓冲液为含有1-5wt% bsa 和 0.05wt% tween-20的pbs缓冲液。

7.根据权利要求5所述的一种用于检测nk细胞活性的试剂盒，其特征在于：所述微球保存液为含有0.01wt%酪蛋白、0.01wt% 叠氮钠的碳酸钾缓冲液，所述碳酸钾缓冲液的浓度为3mm，ph为8.0-10.0。

8.根据权利要求1所述的一种用于检测nk细胞活性的试剂盒，其特征在于：所述结合垫的制备是将生物素标记的ifn-γ、tnf-α和荧光微球标记的亲和素按体积比1-4:1-4:1的比例分散于微球稀释液中，荧光微球标记的dnp-bsa按照2.5%-10%v/v的用量再分散于微球稀释液中，采用定量喷金仪以1-4 μl/cm的喷量包被于处理过的玻璃纤维上，在 37℃鼓风烘干2h后保存备用。

9.根据权利要求8所述的一种用于检测nk细胞活性的试剂盒，其特征在于：所述微球稀释液为含有0.2%v/v吐温20、0.3wt%牛血清白蛋白、0.3%v/v聚乙二醇、5wt%蔗糖、5wt%海藻糖、0.5wt%防腐剂的tris-hcl缓冲液，所述tris-hcl缓冲液的ph为8.0-8.2。

10.根据权利要求1所述的一种用于检测nk细胞活性的试剂盒，其特征在于：所述试纸条的加样垫在制备时采用封闭液处理30min，所述封闭液为含有0.5wt%-3wt%牛血清白蛋白、0.1wt%-0.5wt%酪蛋白、0.1wt%-5wt%pvp、0.02wt%-0.05wt%磷酸二氢钾和0.01wt%-0.1wt% 吐温20的tris缓冲液，所述tris缓冲液的浓度为10-50mm。

技术总结
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测NK细胞活性的试剂盒：包括检测卡、样本稀释液和激活剂；检测卡内部设有试纸条，试纸条的结合垫上包被有生物素标记的IFN‑γ抗体、生物素标记的TNF‑α抗体、荧光微球标记的亲和素以及荧光微球标记的DNP‑BSA；试纸条的硝酸纤维素膜上设有第一检测线、第二检测线和质控线，第一检测线包被有IFN‑γ抗体，第二检测线包被有TNF‑α抗体，质控线包被有兔抗DNP抗体；激活剂包括人白介素IL‑2、IL‑12或两者的组合。本发明的试剂盒采用荧光微球联合生物素‑亲和素放大系统，大大提高了试剂盒的特异性和检测结果的准确性。

技术研发人员：杨帆,李西峰,杨金红,杨艳平,杨致亭
受保护的技术使用者：山东康华生物医疗科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12