血小板抗体检测用指示试剂的制备方法、指示试剂及试剂盒与流程

本发明涉及体外诊断检测，特别是涉及一种血小板抗体检测用指示试剂的制备方法、指示试剂及试剂盒。

背景技术：

1、血小板抗原经输血、妊娠及骨髓移植等可刺激机体产生血小板抗体，致敏血小板并使其破坏，引起血小板减少，导致患者出现淤点、淤斑、出血甚至死亡等严重后果。血小板抗体可引起自身免疫性血小板减少症、同种免疫性血小板减少症、药物引起的免疫性血小板减少症、血小板输注无效症、输血后紫癜以及新生儿同种异体免疫血小板减少症等多种疾病。因此，血小板抗体的检测鉴定及交叉配型在临床血小板免疫性疾病的诊断及输注血小板进行预防和治疗过程中占据非常重要的作用。

2、目前，市场上血小板抗体检测试剂盒的生产厂家并不多，国内主要有长春博德生物技术有限责任公司生产的血小板抗体检测试剂盒(固相凝集法)、天津德祥生物技术有限公司生产的血小板抗体检测试剂盒(固相红细胞法)、长春博迅生物技术有限责任公司生产的血小板抗体检测试剂盒(微柱凝胶)以及国外sanquin blood supply foundationsanquin reagents公司生产的血小板抗体检测试剂盒(固相凝集法)、maspat kit、immucor,inc.公司生产的血小板抗体检测试剂盒(capture法)。以上快速诊断试剂的研制为临床输血安全提供了有效可靠的检测手段。

3、然而，上述血小板抗体检测试剂盒都需要配套有血小板抗体检测用指示红细胞，该指示红细胞的有效期较短，一般只有1.5～2个月，而血小板抗体检测试剂盒有效期为12个月，同批次血小板抗体检测试剂盒需要多批次指示红细胞，导致生产压力较大，批次更换频繁，产品一致性较差等。而指示红细胞试剂的保存条件和运输条件要求比较严格，易产生溶血现象，原料来源不一致导致不同批次致敏效价差异性较大。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种稳定性好、批间差异性小、保质期长、指示颜色显著的血小板抗体检测用指示试剂的制备方法、指示试剂及试剂盒。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种血小板抗体检测用指示试剂的制备方法，采取以下技术方案：

3、取磁珠至离心管中，对所述磁珠表面进行活化；

4、抗人igg抗体透析纯化至少两次；

5、活化后的所述磁珠溶液磁性分离后，去除上清液，加入所述抗人igg抗体和偶联缓冲液，混匀，第一预设条件下偶联形成磁珠-抗人igg抗体偶合物；

6、所述磁珠-抗人igg抗体偶合物磁分离后，加入封闭缓冲液，第二预设条件下封闭处理，磁分离得所述血小板抗体检测用指示试剂。

7、进一步的，当所述磁珠为羧基磁珠时，所述磁珠表面进行活化的步骤包括：

8、在1㎎所述羧基磁珠中加入100～400μl mest溶液，磁分离清洗至少2次；

9、将清洗后的所述羧基磁珠中加入羧基活化液50～200μl，充分混匀后，20～30℃活化20～60min，所述羧基活化液包括5～20mg/ml的n-羟基丁二酰亚胺和5～20mg/ml的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺；

10、当所述磁珠为氨基磁珠时，所述磁珠表面进行活化的步骤包括：

11、在1㎎所述氨基磁珠中加入100～400μl pbs溶液，磁分离清洗至少2次；

12、将清洗后的所述氨基磁珠中加入氨基活化液50～200μl，充分混匀后，20～30℃活化60～120min，所述氨基活化液包括20％～40％的戊二醛溶液。

13、进一步的，所述偶联缓冲液包括100～400mm ph 6.8～7.5的碳酸氢钠缓冲液或50～200mm ph 7.0～8.0的磷酸盐缓冲液中的一个。

14、进一步的，所述血小板抗体检测用指示剂使用前，采用洗涤液清洗至少3次，悬浮于保存溶液中，形成磁珠-抗人igg抗体偶合物悬浮液。

15、进一步的，所述保存液中还包括抑菌剂。

16、此外，本申请还提供一种血小板抗体检测用指示试剂，所述血小板抗体检测用指示试剂采用如上述任一所述的血小板抗体检测用指示试剂的制备方法制备。

17、此外，本申请还提供一种血小板抗体检测试剂盒，包括反应板、低离子强度溶液、浓缩洗涤液以及如上所述的血小板抗体检测用指示试剂，所述反应板具有反应孔，所述反应孔内包被血小板特异性单克隆抗体。

18、进一步的，所述低离子强度溶液包括氯化钠、甘氨酸及防腐剂，所述浓缩洗涤液包括磷酸盐缓冲液、吐温-20以及防腐剂。

19、进一步的，所述低离子强度溶液中还包括溴甲酚紫。

20、进一步的，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照；

21、所述阳性对照含有抗人血小板抗体的基础液；

22、所述阴性对照不含有抗人血小板抗体的基础液。

23、采用本申请提供的血小板抗体检测用指示试剂的制备方法，将经过表面活化处理的磁珠和透析纯化后的抗人igg抗体在特定条件下偶联，得到磁珠-抗人igg抗体偶合物，并进行封闭处理后作为血小板抗体检测用指示试剂。标记有抗人igg抗体的磁珠具有稳定性好、批间差异性小，可作为血小板抗体检测试剂盒中的一个组份，同血小板抗体检测试剂盒有效期一致。同时，因磁珠均一性较好，指示颜色显著，易于观察凝集反应，较好的克服了现有技术中指示红细胞因红细胞破碎导致的阴阳性不易区分等现象。

技术特征：

1.一种血小板抗体检测用指示试剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述血小板抗体检测用指示试剂的制备方法，其特征在于，当所述磁珠为羧基磁珠时，所述磁珠表面进行活化的步骤包括：

3.根据权利要求1所述血小板抗体检测用指示试剂的制备方法，其特征在于，所述偶联缓冲液包括100～400mm ph 6.8～7.5的碳酸氢钠缓冲液或50～200mm ph 7.0～8.0的磷酸盐缓冲液中的至少一个。

4.根据权利要求1所述血小板抗体检测用指示试剂的制备方法，其特征在于，所述血小板抗体检测用指示剂使用前，采用洗涤液清洗至少3次，悬浮于保存溶液中，形成磁珠-抗人igg抗体偶合物悬浮液。

5.根据权利要求4所述血小板抗体检测用指示试剂的制备方法，其特征在于，所述保存液中还包括抑菌剂。

6.一种血小板抗体检测用指示试剂，其特征在于，所述血小板抗体检测用指示试剂采用如权利要求1-5任一项所述的血小板抗体检测用指示试剂的制备方法制备。

7.一种血小板抗体检测试剂盒，其特征在于，包括反应板、低离子强度溶液、浓缩洗涤液以及如权利要求6所述的血小板抗体检测用指示试剂，所述反应板具有反应孔，所述反应孔内包被血小板特异性单克隆抗体。

8.根据权利要求7所述血小板抗体检测试剂盒，其特征在于，所述低离子强度溶液包括氯化钠、甘氨酸及防腐剂，所述浓缩洗涤液包括磷酸盐缓冲液、吐温-20以及防腐剂。

9.根据权利要求8所述血小板抗体检测试剂盒，其特征在于，所述低离子强度溶液中还包括溴甲酚紫。

10.根据权利要求7所述血小板抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照；

技术总结
本发明公开了一种血小板抗体检测用指示试剂的制备方法，取磁珠至离心管中，对磁珠表面进行活化；抗人IgG抗体透析纯化至少两次；活化后的磁珠溶液磁性分离后，去除上清液，加入抗人IgG抗体和偶联缓冲液，混匀，第一预设条件下偶联形成磁珠‑抗人IgG抗体偶合物；磁珠‑抗人IgG抗体偶合物磁分离后，加入封闭缓冲液，第二预设条件下封闭处理，磁分离得血小板抗体检测用指示试剂。还公开了一种血小板抗体检测用指示试剂和血小板抗体检测试剂盒。标记有抗人IgG抗体的磁珠具有稳定性好、批间差异性小，可作为血小板抗体检测试剂盒中的一个组份，同血小板抗体检测试剂盒有效期一致。同时，因磁珠均一性较好，指示颜色显著，易于观察凝集反应。

技术研发人员：张传国,张平,张翠云,汪露,李大成
受保护的技术使用者：深圳市爱康试剂有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13