一种检测希瓦氏菌的比色生物传感器及其制备方法与检测方法

本发明涉及生物检测，具体涉及一种检测希瓦氏菌的比色生物传感器，本发明还涉及该比色生物传感器的制备方法。

背景技术：

1、希瓦氏菌是一种异化铁还原菌，广泛存在于水生和陆地环境。它在地球化学循环、生物腐蚀、生物修复和生物能源中发挥着重要作用。

2、目前，用于细菌分类和鉴定的方法包括传统的增殖、分离、血清和生化鉴定方法；酶联免疫吸附试验(elisa)；聚合酶链反应(pcr)和其他传统方法。到目前为止检测希瓦氏菌的方法主要有如下研究。例如，jung schroers等人比较了生化技术、16s rrna测序、maldi-tof ms和基于脂肪酸乙酯的sherlock微生物鉴定系统(mis)，以鉴定74种希瓦氏菌菌株。最近，yu等人评估了通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(maldi-tof-ms)快速识别shewanella的方法。然而，这些方法要么昂贵、耗时，要么需要复杂的操作。因此，迫切需要开发简单、高灵敏度和更有特异性的方法来检测希瓦氏菌。

3、生物传感器是一种对生物物质敏感并将其浓度转换为电信号进行检测的仪器或系统，分别由生物识别分子、信号转换系统(换能器)、信号放大系统和信号检测系统组成。在过去十年中，生物传感器因其广泛应用、成本低和灵敏快速等优点，主要运用于病原菌、重金属和毒性小分子检测。结合光学传感器的作用机理及优点，除了检测环境中的病原菌以外，对于环境微生物的快速和特异性检测有很大的潜力，并由此可扩展生物传感器的应用。

4、近年来，各种纳米模拟酶作为新一代人工酶，由于其有效催化、易于合成、稳定性好、成本低等独特特性，引起了人们的广泛关注并取得了很大进展。很多酶模拟物-tmb系统中，过氧化氢(h2o2)必须作为氧化剂参与。然而，由于周国环境对h2o2的性质有很大的影响，很难找到直接快速检测h2o2的合适存储，因此开发一款新的纳米模拟酶检测方法，显得尤为必要。

技术实现思路

1、基于以上问题，本发明的第一个目的是提供一种检测希瓦氏菌的比色生物传感器，该传感器灵敏度高，特异性好，为快速筛选希瓦氏菌、深入研究其胞外呼吸机理和生态环境修复应用提供了良好的平台。

2、本发明的第二个目的是提供上述比色生物传感器的制备方法。

3、本发明的第三个目的是该比色生物传感器的使用方法

4、为此，本发明提供的第一个技术方案是这样的：

5、一种检测希瓦氏菌的比色生物传感器，包括表面修饰有链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒、修饰有生物素的希瓦氏菌mr-1多克隆抗体，免疫花状羟基氧化钴纳米酶，希瓦氏菌mr-1。

6、进一步的，上述的检测希瓦氏菌的比色生物传感器，所述的表面修饰有链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒、修饰有生物素的希瓦氏菌mr-1多克隆抗体，以及免疫花状羟基氧化钴纳米酶形成mnp-希瓦氏菌-coooh nfs复合物。

7、本发明提供mnp-希瓦氏菌-coooh nfs复合物原理为：由于本技术提供的色生物传感器包括表面修饰有链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒、修饰有生物素的shewanellaoneidensis mr-1多克隆抗体和免疫花状羟基氧化钴纳米酶(coooh nfs)。根据生物素和链霉亲和素的结合，将生物素化的捕获抗体与链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒偶联，制备免疫磁性纳米颗粒(mnps)。羧基化的coooh纳米花用于与mr-1抗体偶联，制备免疫cooohnfs。将免疫磁性纳米颗粒(mips)、希瓦氏菌和免疫coooh nfs进行充分混合培养，形成mnp-希瓦氏菌-coooh三明治复合物，得到初始溶液。将初始溶液进行磁捕获后得到待测传感器，待测传感器中注入3,3′，5,5′-四甲基联苯胺(tmb)底物，利用待测传感器中的coooh nfs纳米酶对配合物进行催化，生成黄色催化剂。最后检测其吸光度，以确定希瓦氏菌浓度。

8、本发明的第二个目的是提供上述的检测希瓦氏菌的比色生物传感器的制备方法，依次包括下述步骤：

9、1)培养细菌，并且确定菌落总数

10、2)制备抗体

11、将浓度为109cfu/ml处理后的希瓦氏菌液于新西兰雌性大白兔后背分别在不同的点位皮下注射乳化抗原，每个点位注射0.2ml，初次免疫30天后，加强免疫1次，此后每隔10天加强免疫1次，共3次，加强免疫采用弗氏不完全佐剂；最后1次免疫10天后，耳朵静脉取血，先在37℃水浴一小时，置于4℃静置过夜，3000r/min离心，取上清液，得到希瓦氏菌抗体溶液，纯化；

12、3)制备免疫磁性纳米颗粒

13、将200μl链霉亲和素修饰的mnps和10μl生物素化的多克隆抗体加入到含有500μlpbs的离心管中，采用1％bsa封闭；然后，将混合物在15rpm下孵育45分钟；用pbst洗涤除去多余的多克隆抗体后，形成免疫mnps，并储存在4℃的500μl pbs中；

14、4)制备免疫coooh纳米花

15、将10ml coooh nfs以10,000rpm的转速离心10分钟，以除去上清，并与2ml去离子水重新悬浮；取edc和nhs稀释液各5ml，将coooh稀释液与edc/nhs混合，使coooh/edc/nhs达到1∶1∶1在15rpm的速度混合1h；将上述反应后的混合物和250μl步骤2)制备的抗体混合，室温下15rpm孵育1h；通过配位络合作用接上抗体，最终得到免疫coooh纳米花，将抗体成功固定在coooh nfs后，加入200μl的10.0％bsa对免疫coooh nfs，孵育1h，以阻断活性位点；然后在500μl的含1％bsa的pbs中离心重悬，最后将其储存在4℃的棕色烧瓶中；

16、5)制备三明治复合物的

17、将200μl免疫后的mnps、500μl含不同浓度希瓦氏菌的样品、100μl免疫后的cooohnfs在15rpm下孵育30min，形成mnp-细菌-coooh三明治复合物，得到初始溶液，再将初始溶液富集后得到待测传感器。

18、进一步的，上述的检测希瓦氏菌的比色生物传感器的制备方法，所述的细菌的培养依次包括下述步骤：

19、(1)配制液体培养基：向锥形瓶加入4.2g lb肉汤粉和200ml去离子水，超声搅拌溶解，用封口，并放入灭菌锅高温灭菌，得lb液体培养基；

20、(2)复苏细菌：将冷冻的细菌放在4℃冰箱中进行解冻后，加入到步骤(1)的lb液体培养基中混合均匀并放入摇床中培育24h；

21、(3)配制固体lb培养基：将5gnacl、2.5g酵母、5g胰蛋白胨、10g琼脂溶于500ml去离子水中混合均匀；将配好的液体培养基倒入多个培养皿中制作lb固体培养基；

22、进一步的，上述的检测希瓦氏菌的比色生物传感器的制备方法，所述的细菌包括希瓦氏菌、腐败希瓦氏菌、地杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。

23、进一步的，上述的检测希瓦氏菌的比色生物传感器的制备方法，所述的coooh、edc、nhs的体积比为1∶1∶1。

24、进一步的，上述的检测希瓦氏菌的比色生物传感器的制备方法，所述的希瓦氏菌的样品的浓度分别为：5×103cfu/ml、5×104cfu/ml、5×105cfu/ml、5×106cfu/ml、5×107cfu/ml、5×108cfu/ml、5×109cfu/ml。

25、进一步的，上述的检测希瓦氏菌的比色生物传感器的制备方法，所述的初始溶液富集方法是将初始溶液通过试管置于磁铁上，将复合物磁性分离，收集磁铁吸附的物质，再用500μl pbst洗涤3～5次，去除杂质，得到比色生物传感器。

26、本发明的第三个目的是提供上述的检测希瓦氏菌的比色生物传感器的使用方法，该方法依次包括下述步骤：

27、1)将比色生物传感器注入200μl tmb，催化15min，以100μl、1.5m稀硫酸终止；

28、2)将催化反应后的溶液转移到96孔板中，用酶标仪测量其吸光度；通过系列浓度希瓦氏菌的峰值处吸光度值做标准曲线，计算待测液中希瓦氏菌的浓度。

29、与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下技术优点：

30、(1)本发明提供的技术方案利用抗原和抗体之间的特异性相互作用和免疫磁性捕获，构建了一种用于希瓦氏菌检测的三明治型比色传感器，可以有效地富集和分离希瓦氏菌，以提高传感器的灵敏度和特异性；

31、(2)本发明提供的技术方案将具有高模拟酶活性和良好稳定性羟基氧化钴纳米花(coooh nfs)用作放大生物信号的探针，不需要任何氧化剂参与tmb反应，具有制备简单、反应条件温和、成本低、稳定性好，生物相容性好等优点；

32、(3)本发明提供的技术方案利用紫外测量吸光度，得到吸光度与细菌数量的关系，通过紫光吸收光谱仪判定结果，实现对希瓦氏菌的快速检测；

33、(4)本发明提供的比色传感器该传感器制备方法简单，传感器灵敏度高，特异性好，对为快速筛选希瓦氏菌、深入研究其胞外呼吸机理和生态环境修复应用提供技术支持。

34、总而言之，本发明构建的比色生物传感器，利用抗原抗体之间的特异性相互作用和免疫磁捕获，对希瓦氏菌进行有效的富集和分离，提高传感器的灵敏度和特异性；利用模拟酶活性较高、稳定性较好的coooh nfs作为有效放大生物信号的信号探针，与过氧化物酶类似物或氧化酶类似物相比，羟基氧化钴纳米花(coooh nfs)因其不需要任何氧化剂参与tmb反应，具有制备简单、反应条件温和、成本低、生物相容性好等优点；该传感器制备方法简单，性能稳定，tmb的重复性好，可在45min内对5×103～5×109cfu/ml的希瓦氏菌进行检测，有望对为快速筛选希瓦氏菌、深入研究其胞外呼吸机理和生态环境修复应用提供技术支持。