一种基于振镜扫描的双光束场干涉光片显微成像方法和装置

本发明属于光学超分辨显微成像领域，特别涉及一种基于振镜扫描的双光束场干涉光片显微成像方法和装置。

背景技术：

1、光学显微镜是进行生命科学研究的重要工具之一。光片荧光显微镜采取侧向照明和宽场探测的策略，同时兼具良好的光学层切能力和快速成像的能力，有效避免样品的轴外激发，有利于降低对活细胞样品造成的光毒性影响，是长时程动态观测和研究活细胞样品的重要手段之一。光片显微镜的横向分辨率主要取决于探测物镜的数值孔径，而其轴向分辨率则由激发光片的厚度和探测物镜的数值孔径(na)共同决定。

2、近年来，为了提高光片显微镜的成像分辨率和保证探测荧光的收集效率，光片显微成像系统一般采用较高na的探测物镜。为了进一步压缩光片的厚度以提高其轴向分辨率，早期科研工作者尝试采用较高na的激发物镜产生较薄的高斯光片，但是由于快速汇聚的高斯光片也会快速地发散，造成视场变小的问题。后续，贝塞尔光束替换高斯光束作为激发光源，可以在光片主瓣较薄的同时保证视场足够大，但也引入了旁瓣，造成了样品的轴外激发，降低成像信噪比和更早地引入光毒性和光漂白问题。

3、为了解决贝塞尔光束旁瓣带来的问题，公开号为cn110220875a的专利申请提供一种晶格光片显微镜，晶格光片显微镜产生相干贝塞尔光束阵列，利用干涉相消效应成功抑制贝塞尔光束的旁瓣，得到厚度薄、视场大的晶格光片。但是，原始的晶格光片显微成像系统采用二值空间光调制器和掩模板对光束进行调制和滤波，造成系统的光能利用率低效的问题。场合成光片显微镜配合声光可调谐滤波器和振镜，对入瞳进行扫描，可产生与晶格光片显微镜抖动模式下相类似的光片，大大提升系统的光能利用率。但该系统无法与结构光照明显微成像技术兼容，使得其横向成像分辨率难以进一步提高，同时由于入瞳需要扫描，一定程度上损害了成像速度。另外，公开号为cn106770288a的专利申请提供一种共光路干涉相位显微成像系统，双光干涉光片显微镜利用两个透光圆环对光束进行滤波，可获取较薄的光片，但同样也无法兼容结构光显微成像技术。

技术实现思路

1、本发明提供了一种基于振镜扫描的双光束场干涉光片显微成像方法和装置，利用振镜扫描灵活切换入瞳处光束na以产生不同周期和厚度的干涉条纹以照明样品，可结合结构光照明显微成像技术，在低入射光功率亦可在光束扫描方向上获取超过衍射极限的分辨率。

2、为实现上述的发明目的，本发明所采用的具体技术方案如下：

3、一种基于振镜扫描的双光束场干涉光片显微成像方法，包括以下步骤：

4、1)激光光束分成两路振动方向相同的线偏振光；

5、2)两路线偏振光整形成线状光束，经激发物镜投射到荧光样品上发生相互干涉产生条纹结构光照明图样；

6、3)多次改变干涉条纹的相位，探测物镜收集对应相位下的多幅荧光强度图像；

7、4)利用多幅荧光强度图像进行数据处理，重构得到超分辨图像。

8、在步骤3)中，需要至少三次改变干涉晶格条纹的相位使光片以结构光条纹或均匀的光片照明样品。

9、本发明中，单幅结构光图样投射到样品上获得的荧光强度信息中包含三个频率分量，为了分离这三个频率分量，需要得到三个方程。本发明通过电光调制器对光束的光程进行快速改变，从而改变投射到样品上的干涉晶格条纹的相位，得到三幅相移后的荧光图像，从而对频率分量进行提取和移动。

10、作为优选的，电光调制器可以控制干涉晶格条纹相移0°、120°和240°。此处仅限于作为最优的实例，从理论上来说，相移角度可以是任意的数值，仅需保证样品可以得到均匀的照明即可。相比传统晶格光片显微成像方法中的结构光照明模式，本发明只需进行三步相移采取三张图片即可进行图像重构，成像速度可进一步提升5/3倍。另外，也可以令电光调制器快速地改变光束的相位，从而形成均匀的照明光片，该操作与晶格光片显微镜的抖动模式相匹配，相比结构光照明模式，其成像速度更快但成像分辨率相对较低。

11、本发明与传统二维超分辨结构光照明算法和传统晶格光片显微镜抖动模式下的成像技术所运用的图像重构算法兼容，在图像数据处理和重构可基于现有的算法实现。

12、本发明提供一种基于振镜扫描的双光束场干涉光片显微成像装置，包括激发光路模块和成像光路模块；

13、所述的激发光路模块具有依次布置的：

14、激光器，发出激光光束；

15、振镜分束系统，用于将激光光束分成两束传播方向对称且振动方向相同的线状线偏振光并从激发物镜后焦面的边缘入射照明样品；

16、z扫描振镜，用于扫描光束，对样品进行轴向扫描；

17、激发物镜，用于将两束线状光束聚焦到样品表面进行干涉产生干涉晶格条纹图案，并激发样品荧光强度信号；

18、所述的成像光路模块包括：

19、探测物镜，用于收集样品的荧光信号；

20、相机，用于记录所述的荧光强度信号；

21、计算机，用于控制所述中心光束整形系统和振镜分束系统改变干涉晶格图案的相位、数值孔径和旋向；用于控制所述z扫描振镜对样品进行轴向扫描；用于控制所述相机采集的荧光强度信号；并用于数据处理，得到超分辨图像。

22、作为优选的，所述的振镜分束系统包括：

23、偏振分束镜，用于将入射的圆偏振光分成两路线偏振光光束；

24、依次设置在偏振分束镜的透射光路上的四分之一波片、反射镜、第一柱透镜、第一扫描振镜和第一扫描透镜；所述的第一四分之一波片用于将线偏振光转换成圆偏振光，反射镜用于反射圆偏振光再次通过第二四分之一波片变成s偏振光，能被第二偏振分束镜再次反射；所述的第一柱透镜用于对圆形激光光束进整形，形成沿着z方向进行压缩、x方向保持平行的线状线偏振光；所述的第一扫描振镜用于对光束在激发物镜入瞳处沿着x方向进行扫描；所述的第一扫描透镜用于将线状光束转变成沿着x方向进行压缩、z方向保持平行的线状线偏振光；

25、依次设置在偏振分束镜的反射光路上的电光调制器、第二柱透镜、第二扫描振镜和第二扫描透镜；所述的电光调制器用于快速控制反射光路光束的光程，从而改变在样品平面出干涉晶格条纹的相位；所述的第二柱透镜用于对圆形激光光束进整形，形成沿着z方向进行压缩、x方向保持平行的线状线偏振光；所述的第二扫描振镜用于对光束在激发物镜入瞳处沿着x方向进行扫描；所述的第二扫描透镜用于将线状光束转变成沿着x方向进行压缩、z方向保持平行的线状线偏振光；

26、本发明中，所述的振镜分束系统包括：三角反射镜，用于将从第一扫描振镜和第二扫描振镜出射的两路线偏振光进行合束；环形掩膜板，用于对合束的两路线偏振光进行滤波。

27、所述激光器与中心光束整形系统之间依次放置有：准直透镜，用于激光光束进行准直；起偏器，用于将激光光束变为线偏振光；和二分之一波片，用于改变线偏振光的旋向，调节从偏振分束镜透射和反射两束线偏振光的光强比例。

28、所述振镜分束系统和激发物镜之间依次放置有z扫描振镜、第三扫描透镜和第一管镜。所述z扫描振镜用于控制光束沿着z方向扫描待测样品；所述的第三扫描透镜和管镜构成4f系统，用于将z扫描振镜上的光束共轭到激发物镜的后焦面。

29、所述激发物镜用于将两束振动方向相同的线状线偏振光传递到待测样品表面进行干涉产生干涉条纹。

30、所述成像光路模块依次布置探测物镜、滤光片、第二管镜和相机。所述探测物镜与激发物镜相互垂直，用于收集样品的荧光信号；所述滤光片用于滤去待测样品发出的荧光中的杂散光；所述管镜用于将荧光信号聚焦到相机。

31、在另一个技术方案中，本发明还提供一种基于振镜扫描的双光束场干涉光片显微成像装置，包括激发光路模块和成像光路模块；

32、所述的激发光路模块具有依次布置的：

33、激光器，发出激光光束；

34、振镜分束系统，用于将激光光束分成两束传播方向对称且振动方向相同的线状线偏振光并从激发物镜后焦面的边缘入射照明样品；

35、z扫描振镜，用于扫描光束，对样品进行轴向扫描；

36、激发物镜，用于将两束线状光束聚焦到样品表面进行干涉产生干涉条纹图案，并激发样品荧光强度信号；

37、所述的成像光路模块包括：

38、探测物镜，用于收集样品的荧光信号；

39、相机，用于记录所述的荧光强度信号；

40、计算机，用于控制所述中心光束整形系统和振镜分束系统改变干涉图案的相位、数值孔径和旋向；用于控制所述z扫描振镜对样品进行轴向扫描；用于控制所述相机采集的荧光强度信号；并用于数据处理，得到超分辨图像。

41、作为优选的，所述的振镜分束系统包括：

42、第一偏振分束镜，用于将入射的圆偏振光分成两路线偏振光光束；

43、依次设置在第一偏振分束镜的透射光路上的第一柱透镜、第一扫描振镜、第一扫描透镜和第二二分之一波片；所述的第一柱透镜用于对圆形激光光束进整形，形成沿着z方向进行压缩、x方向保持平行的线状线偏振光；所述的第一扫描振镜用于对光束在激发物镜入瞳处沿着x方向进行扫描；所述的第一扫描透镜用于将线状光束转变成沿着x方向进行压缩、z方向保持平行的线状线偏振光；所述的第二二分之一波片用于改变光束的偏振态为s偏振光束。

44、依次设置在第一偏振分束镜的反射光路上的电光调制器、第二柱透镜、第二扫描振镜、第二扫描透镜和第三二分之一波片；所述的电光调制器用于快速控制反射光路光束的光程，从而改变在样品平面出干涉条纹的相位；所述的第二柱透镜用于对圆形激光光束进整形，形成沿着z方向进行压缩、x方向保持平行的线状线偏振光；所述的第二扫描振镜用于对光束在激发物镜入瞳处沿着x方向进行扫描；所述的第二扫描透镜用于将线状光束转变成沿着x方向进行压缩、z方向保持平行的线状线偏振光；所述的第三二分之一波片用于改变光束的偏振态为p偏振光束。

45、本发明中，所述的振镜分束系统包括：第二偏振分束镜，用于将经过第一扫描透镜和第二扫描透镜出射的线偏振光进行合束；第二四分之一波片，用于将经过第一扫描透镜和第二扫描透镜出射的线偏振光进行转变成圆偏振光；所述的振镜分束系统包括：环形掩膜板，用于对合束的两路圆偏振光进行滤波；切向光偏振片，用于将对两束圆偏振光转变成切向线偏振光。

46、所述激光器与第一偏振分束镜之间依次放置有：准直透镜，用于激光光束进行准直；起偏器，用于将激光光束变为线偏振光；和第一二分之一波片，用于改变线偏振光的旋向，调节从偏振分束镜透射和反射两束线偏振光的光强比例。

47、所述振镜分束系统和激发物镜之间依次放置有z扫描振镜、第三扫描透镜和第一管镜。所述z扫描振镜用于控制光束沿着z方向扫描待测样品；所述的第三扫描透镜和管镜构成4f系统，用于将z扫描振镜上的光束共轭到激发物镜的后焦面。

48、所述激发物镜用于将两束振动方向相同的线状线偏振光传递到待测样品表面进行干涉产生干涉条纹。

49、所述成像光路模块依次布置探测物镜、滤光片、第二管镜和相机。所述探测物镜与激发物镜相互垂直，用于收集样品的荧光信号；所述滤光片用于滤去待测样品发出的荧光中的杂散光；所述管镜用于将荧光信号聚焦到相机。

50、与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

51、(1)使用振镜分束系统代替空间光调制器和常规光栅器件获取激发物镜后焦面的光场分布和前焦面处干涉图样，提高了入射光能量利用率；

52、(2)相比双环干涉的光片显微成像系统或贝塞尔光片显微成像系统，利用双光束干涉可以获得干涉条纹，使成像模式兼容结构光照明显微成像方法，有利于进一步提升成像分辨率；

53、(3)使用电光调制器控制反射路的光程从而改变激发物镜前焦面反射图像的相位，相比传统的角锥棱镜位移精确度高、调制速度快；相比传统晶格光片显微成像方法，成像速度可进一步提升5/3倍；

54、(4)使用扫描振镜可灵活改变光束在激发物镜后焦面的分布，改变光束的na，在样品面上获取不同模式的晶格图案；

55、(5)本发明装置灵活，入射光能量利用率高，干涉晶格条纹对比度高，成像速度快，特别适用于生命科学领域中对荧光样品进行成像。