一种基于三维分级多孔碳材料增敏效应的克百威适配体电化学传感器及其应用方法

本发明涉及电化学分析检测，特别涉及一种基于三维分级多孔碳材料增敏效应的克百威适配体电化学传感器及其应用方法。

背景技术：

1、克百威(carbofuran，2,3-二氢-2,2-二甲基-7-苯并呋喃基-n-甲基氨基甲酸酯；简称：cbf)，分子式为c12h15no3，是毒性最大的n-甲基氨基甲酸酯农药之一，广泛用于防治各种粮食、蔬菜、水果和经济作物的病虫害。它在酸性土壤中难以降解，污染土壤和水，特别是在蔬菜和粮食作物中大量使用，形成农药残留，直接威胁公众健康和环境。它的毒性包括抑制胆碱酯酶，强烈的吸入性惊厥和神经肌肉障碍。鉴于其适用性广、毒性高，许多国家都对农产品中cbf的残留制定了严格的规定。我国也对其在农产品中的含量做出了严格规定，如cbf在糙米、甜菜、根茎类调味料、棉籽、葵花籽中的最大残留量为0.1mg/kg，麦类、早粮类、杂粮类、油菜籽、哺乳动物类中的最大残留量为0.05–0.1mg/kg，蔬菜、水果、甘蔗、药用植物食用菌和茶叶中的最大残留量为0.02mg/kg等，因此对cbf的监管需要有灵敏、准确的分析技术作为支撑。

2、目前检测cbf的方法和技术有多种，传统的方法如气相色谱法、高效液相色谱法、色谱质谱联用技术等，虽然这些具有高选择性和精确度，但仍存在样品前处理复杂、成本高、仪器设备昂贵、需专门人员操作、检测时间长、不适合现场检测等缺点，因此不适用于农产品的快速检测需求。适配体是由体外selex(配体指数富集系统进化)筛选的人工单链dna或rna序列，可与广泛的靶点结合，具有极高的特异性和稳定性。近年来，基于适配体的传感器在农药残留检测中引起了广泛关注并取得良好的分析效果。

3、适配体传感器的构建的关键步骤是适配体在电极表面的固定，因为其对适配体传感器的稳定性、灵敏度和选择性等主要性能产生直接影响，三维分级多孔碳材料(hpc)具有比表面积大、同时存在大孔/介孔/微孔、孔道网络结构发达、导电性好、化学/热稳定性好等优点，是一种理想的适配体传感器构建材料，目前仍鲜见有以hpc作为电化学界面支撑材料的适配体电化学传感器报道。

4、公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

1、本发明针对上述技术问题，发明一种基于三维分级多孔碳材料增敏效应的克百威适配体电化学传感器及其应用方法。

2、为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

3、一种基于三维分级多孔碳材料增敏效应的克百威适配体电化学传感器，制备方法包括以下步骤：

4、(1)三维分级多孔碳材料的制备：将海藻酸钠在氮气氛围下高温碳化得到碳材料，随后，在磁力搅拌下将碳材料浸入hcl溶液来去除无机杂质，再用去离子水洗涤至中性，过滤收集黑色固体，干燥后即得三维分级多孔碳材料，将三维分级多孔碳材料记为hpc；

5、(2)aunps/hpc的制备：将氯金酸溶于去离子水中得到溶液a，将聚乙烯邻苯二酮加入hpc水悬液中，超声处理后得到溶液b；将溶液a缓慢加入到溶液b中，搅拌混匀后得到au3+/hpc混合液；再加入抗坏血酸溶液，室温反应0.5-2h，反应结束后，过滤、清洗产物，烘干后得到aunps@hpc纳米材料；

6、(3)aunps@hpc/chit分散液的制备：将壳聚糖用醋酸溶液溶解，制得壳聚糖溶液，将步骤(2)制备得aunps@hpc纳米材料均匀分散于壳聚糖溶液中，得到aunps@hpc/chit分散液；

7、(4)tris-hc缓冲液的配制：取1.21g三(羟甲基)氨基甲烷溶于800ml水，再用hcl调ph至8.5，定容至1000ml，得到浓度为10mmol/l的tris-hc缓冲液；

8、(5)1mmol/l 6-巯基-1-己醇的制备：取1.0g/ml的6-巯基-1-己醇，先用乙醇溶解，再用tris-hcl缓冲液定容到浓度为1mmol/l；

9、(6)5.0mmol/l[fe(cn)6]3-/4-/0.1mol/lkcl溶液的配置：称取0.07455gkcl，铁氰化钾0.01646g，亚铁氰化钾0.01842g用去离子水溶解，再定容到10ml，得到5.0mmol/l[fe(cn)6]3-/4-/0.1mol/lkcl溶液；

10、(7)克百威核酸适配体溶液的制备：

11、克百威核酸适配体序列号为：5′-cacctgggggagtattgcggaggaaagagaacactggggcagatatgggccagca ggtc-(ch2)6-sh-3′；将克百威核酸适配体粉剂用tris-hcl缓冲液配制成浓度为5.0μmol/l的克百威核酸适配体溶液；

12、(8)克百威适配体电化学传感器的制备：将玻碳电极(gce)抛光、清洗、干燥，将步骤(3)制备的aunps@hpc/chit分散液取5μl滴到玻碳电极上，得到修饰电极，记为aunps@hpc/chit/gce，随后在aunps@hpc/chit/gce表面加入6μl的5.0μmol/l的克百威核酸适配体溶液，在20-40℃下孵育60-100min，然后用tris-hcl缓冲液冲洗修饰电极表面，得到用核酸适配体修饰的电极，标记为apt/aunps@hpc/chit/gce，将apt/aunps@hpc/chit/gce浸入入1mmol/l 6-巯基-1-己醇中室温保存1h，然后用tris-hcl缓冲液洗涤，得到克百威适配体电化学传感器，标记为mch/apt/aunps@hpc/chit/gce。

13、优选地，在步骤(1)中将海藻酸钠在氮气氛围下高温碳化得到碳材料得发方法为：将5g海藻酸钠置于石英舟中放入管式炉，在通入氮气1h后，以3℃/min的升温速度升到目标温度900℃，然后在设定温度下保持1h，自然降温后即可获得碳材料；在步骤(1)中，hcl溶液得浓度为3mol/l，干燥方法为在100℃干燥12h。

14、优选地，在步骤(2)中：将0.12mmol氯金酸溶于20ml去离子水中搅拌分散得到溶液a；将50mg聚乙烯邻苯二酮加入40ml hpc水悬液中，在室温下超声30min得到溶液b，所述hpc水悬液得浓度为1mg/ml；将溶液a缓慢加入到溶液b中之后，用1mol/l的hcl溶液调节ph至3-5，在室温下搅拌30min得到au3+/hpc混合液；抗坏血酸与au的摩尔比为3:1，加入抗坏血酸溶液后在室温下反应1h，反应结束后，用孔径2μm的玻璃砂芯漏斗过滤产物，先用无水乙醇再用去离子水冲洗，重复3次，最后，将产物在恒温烘箱中60℃真空干燥12h，得到aunps@hpc纳米材料。

15、优选地，在步骤(3)中，醋酸溶液的浓度为1％，壳聚糖溶液的浓度为0.25％，将步骤(2)制备得aunps@hpc纳米材料用超声波均匀分散于壳聚糖溶液中，得到浓度为1.5mg/ml的aunps@hpc/chit分散液。

16、优选地，在步骤(5)中，取1.0g/ml的6-巯基-1-己醇0.134ml，先用10ml乙醇溶解，再用tris-hcl缓冲液定容到1000ml，得到1mmol/l的6-巯基-1-己醇。

17、优选地，在步骤(8)中，将玻碳电极(gce)抛光、清洗、干燥的方法为：将直径为3mm的玻碳电极(gce)用0.05μm的al2o3粉末在麂皮上抛光至镜面，用去离子水洗去表面残留的粉末，再依次用的hno3水溶液、无水乙醇和去离子水超声清洗3min，然后自然干燥，所述hno3水溶液中hno3与水的体积比为1:1；在加入克百威核酸适配体溶液之后，在在37℃孵育80min。

18、本发明还提供了所述克百威适配体电化学传感器的应用方法，包括以下步骤：

19、(a)标准溶液的配制：称取克百威标样和甲醇配制0.5mg/ml的母液，分别量取一定量的母液加入tris-hcl缓冲液中，定容得到一系列不同浓度的克百威标准溶液；

20、(b)标准曲线的绘制：将mch/apt/aunps@hpc/chit/gce插入5.0mmol/l[fe(cn)6]3-/4-/0.1mol/lkcl溶液中在-0.3～0.5v范围内进行差分脉冲伏安(dpv)扫描，测得0.145±0.1v的电流峰值，记为i0；再将mch/apt/aunps@hpc/chit/gce插入含有不同浓度克百威标准溶液中孵育40min，然后插入5.0mmol/l[fe(cn)6]3-/4-/0.1mol/l kcl溶液中在-0.3～0.5v范围内进行差分脉冲伏安(dpv)扫描，记录0.145±0.1v的电流峰值，记为i1；电流峰值的变化与克百威浓度的对数呈良好的线性关系，根据其所对应的克百威浓度值绘制标准曲线，进而得到相应的线性方程；将上述克百威标准溶液替换成待测样，按照相同的操作，测得0.145±0.1v的电流峰值变化带入所得线性方程算得出待测样中克百威的含量；

21、在1.0～100000pg/l范围内线性方程为:δi(10-5a)＝0.8792logccbf(pg/l)+0.7736，相关系数r2＝0.9997；其中δi＝i0-i1，c为克百威的浓度；该方法的检出限为：0.5pg/l(s/n＝3)。

22、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

23、本发明在不添加任何活化剂的情况下，通过海藻酸钠直接炭化法制备了三维分级多孔碳材料hpc，再通过抗坏血酸还原法制备多孔碳负载纳米金材料(aunps@hpc)，使用壳聚糖将aunps@hpc稳定的分散到电极表面，通过au-s键将cbf适配体固定在载体上，基于aunps@hpc超大的比表面积、良好的生物相容性、优异的电催化能力，建立了一种超灵敏、高选择性的克百威适配体电化学传感器，该电化学传感器用于检测克百威，相比文献报道的同类方法显示出更为优异的分析性能，同时常见的共存农药对检测也无明显干扰。