磷酸化肽段富集试剂盒、自动化高通量装置及其富集方法与流程

本发明涉及蛋白质磷酸化修饰领域，尤其涉及一种磷酸化肽段的自动装置，具体涉及用于磷酸化肽段富集的自动化高通量装置及其富集方法。

背景技术：

1、蛋白质的磷酸化修饰是研究最广、最重要的翻译后修饰之一。人体中30％的蛋白都可以发生磷酸化，而蛋白质之间的磷酸化水平差异巨大，可能低于1％，也可能在90％以上。同时，蛋白的磷酸化和非磷酸化状态可能同时存在，因此多种亚型共存的磷酸化/蛋白增加了磷酸化修饰研究的复杂度。有文献推断，磷酸化肽在总酶切多肽中的比例可能不足5％，而大量非修饰肽对磷酸化肽段的掩盖，抑制了磷酸化肽段的离子化。因此，在磷酸化蛋白分析前，需要对磷酸化蛋白/肽段进行特异性富集。随着大队列生物样本的引入，传统的低通量的样本前处理方式不可避免的引入很多人为误差，成为限制磷酸化蛋白组学发展的瓶颈之一。高效、高通量的磷酸化富集技术有利于提高磷酸化蛋白组分析的整体性能、覆盖深度和可重复性，降低人为因素引入的测量误差。

2、中国专利文件cn108132180b提供的富集策略是利用富集材料与磷酸化肽段特异性结合来富集酶解产物中的磷酸化肽段。该策略通过将酶解产物与富集材料、清洗溶液、洗脱液等在ep管中进行混合孵育，再离心用移液枪手动移除上清液，这种方式非常容易造成富集材料的损失或者清洗液的残留，导致损失磷酸化肽段并降低富集特异性。中国专利文件cn110922448a提供了一种磷酸化肽段富集装置，该装置以顶部具有开口、侧壁有通气孔的管子作为支撑和收集器，肽段溶液与富集材料先孵育后再用移液枪手动转到移分离柱中进行离心、清洗，这种方法同样会造成部分富集材料和磷酸化肽段的丢失。

3、除此之外，上述两种方法的单个样品的富集时间都在2小时以上，并且无法实现高通量的样本富集。并且由于是人员操作，由于专业程度不同、心理生理状态等多种因素都会导致操作的平行性不理想，因此，亟需一种自动化的、高通量的磷酸化肽富集方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有磷酸化肽段富集方法和手段存在的不足和缺陷，提供一种磷酸化肽段富集试剂盒、自动化高通量装置及其富集方法，通过该磷酸化肽段富集试剂盒以及自动化高通量装置可以实现自动化、简单、快速、高效、高通量的磷酸化肽段富集方法。

2、为了实现上述目的，本发明的一个方面，提供了一种磷酸化肽段富集试剂盒，所述磷酸化肽段富集试剂盒包括裂解液、还原烷基化试剂、酶、终止液、脱盐柱、清洗液、第一洗脱液、富集小柱、平衡清洗液a、平衡清洗液b、第二洗脱液c以及第三洗脱液d；

3、其中，

4、所述还原烷基化试剂包括还原试剂以及烷基化试剂，所述还原试剂为二硫代苏糖醇(dtt)或三(2-羧乙基)膦盐酸盐(tcep)，优选为5-20mm tcep；所述烷基化试剂为氯乙酰胺(caa)，优选为10-40mm caa；

5、所述富集小柱为两端开口的套管，其内部由下到上分别设有第一筛板、富集材料和第二筛板，所述第一筛板与第二筛板的直径不同。

6、优选地，所述裂解液为1％脱氧胆酸钠(sdc)或0.1m的尿素；优选为0.1m尿素；

7、酶为胰蛋白酶或者胰蛋白酶与重组赖氨酸酶混合物，优选为胰蛋白酶与重组赖氨酸-酶混合物；

8、终止液为10v/v％有机酸，有机酸为乙酸、甲酸或三氟乙酸，优选为三氟乙酸(tfa)；

9、脱盐柱的填料为反相色谱填料优选为c18；

10、清洗液为2v/v％乙腈(acn)以及0.1v/v％三氟乙酸(tfa)；

11、第一洗脱液为90v/v％乙腈；

12、填入的肽段与所述富集小柱中的富集材料的质量比为1:5-1:15，优选地，所述富集材料采用tio2；

13、所述平衡清洗液a为60v/v％-85v/v％乙腈、1％-5％三氟乙酸以及100mm-1m羟基乙酸，使用时，每次加入体积为20-100μl；

14、所述平衡清洗液b为60％-85v/v％乙腈以及0.1％-0.5v/v％三氟乙酸，使用时，每次加入体积为20-100μl；

15、所述第二洗脱液c为1v/v％-10v/v％氨水，使用时，加入体积为50-100μl；

16、所述第三洗脱液d为30v/v％-100v/v％乙腈，使用时，加入体积为50-100μl。

17、第二方面，本发明提供了一种用于磷酸化肽段富集的自动化高通量装置，所述自动化高通量装置包括上述的磷酸化肽段富集试剂盒以及配合所述磷酸化富集试剂盒所使用的自动化移液工作站。

18、优选地，所述的自动化移液工作站包括：

19、台架本体，所述台架本体设有可启闭透明板；

20、机械臂，所述机械臂位于所述台架本体内，所述机械臂受控制模块控制沿沿台架本体的x轴、y轴以及z轴移动，机械臂上设有移液枪；

21、板位台，所述板位台位于所述台架本体底部，所述板位台设有废液槽；

22、以及加热震荡模块，所述加热震荡模块位于所述台架本体内，其通过控制模块实现自主控温。

23、优选地，所述自动化移液工作站还包括枪头载架，以容置枪头。

24、优选地，所述自动化移液工作站包括以下其中之一：

25、(a)至少一个8通道的移液枪，优选地为1-2把；

26、(b)板位台内分为至少一个板位，优选地为11个板位；

27、(c)所述枪头载架至少为一个96孔枪头载架，优选地为2个。

28、第三方面，本发明提供了一种自动化高通量的磷酸化肽段富集方法，所述方法采用上述的自动化高通量装置进行磷酸化肽段富集。

29、优选地，所述方法包括如下步骤：

30、s1:将组织样本置于自动化移液工作站的板位台内的板位中，并通过加热震荡模块加热震荡；

31、s2：通过自动化移液工作站自动加入磷酸化肽段富集试剂盒内的各个试剂对组织样本进行裂解、清洗以及洗脱，以获得肽段样本；

32、s3：将肽段样本取出放入真空浓缩仪中抽干；

33、s4：将抽干后的肽段样本重新置入自动化移液工作站内进行富集操作，最终获得磷酸化肽。

34、优选地，所述方法还包括步骤s5，所述步骤s5为：将磷酸化肽取出放入真空浓缩仪中抽干。

35、优选地，所述磷酸化肽段富集方法至少包括以下操作的其中之一：

36、(1)裂解液、还原烷基化试剂、酶、终止液、清洗液和第一洗脱液转移到储液槽中，置于移液工作站内相应的板位；枪头及除盐枪头置于移液工作站内的对应枪头载架上；准备4个96孔板，分别标注：s，wash1，wash2，elute，并置于自动化移液工作站的相应板位上；

37、(2)将组织样本置于96孔板s板中，放入自动化移液工作站的加热震荡模块上，优选每孔对应的肽段质量在20μg-500μg，组织样本选自下述其中之一：蛋白溶液或细胞沉淀/研磨好的样本材料；

38、(3)通过操作移液枪进行自动移液，每孔加入裂解液和还原烷基化试剂，于95℃以及800rpm加热震荡5min；

39、(4)待恢复至室温，通过操作移液枪进行自动移液，每孔加入平衡清洗液a、平衡清洗液b和酶，于37℃以及800rpm加热震荡120min，优选，肽段的浓度为0.1-50μg/μl之间；

40、(5)通过操作移液枪进行自动移液，加入终止试剂，吹打混匀10次；

41、(6)通过操作移液枪进行自动移液，加入终止试剂到wash1板中，优选每孔150μl；

42、(7)通过操作移液枪进行自动移液，加入清洗液到wash2板中，每孔150μl；

43、(8)自动化工作站自动移液，加入第一洗脱液到elute板中，每孔150μl；

44、(9)自动化移液工作站操作机械臂依次拾取除盐枪头，先到达s板对应位置，反复吹吸2次，以使多肽结合到除盐枪头上，不弃去枪头；

45、(10)通过操作机械臂将步骤(9)中的除盐枪头转移到wash1板中对应位置，反复吹吸2次，以清洗肽段，不弃去枪头；

46、(11)通过操作机械臂支配步骤(10)中的除盐枪头转移到wash2板中对应位置，反复吹吸2次，以清洗肽段，不弃去枪头；

47、(12)通过操作机械臂支配步骤(11)中的除盐枪头转移到elute板中对应位置，反复吹吸2次，以洗脱肽段，收集洗脱液并弃去枪头；

48、(13)循环步骤(9)至步骤(12)直至所有样本都洗脱完毕；

49、(14)将洗脱下来的肽段样本取出放入真空浓缩仪中抽干；

50、(15)自动化移液工作站内更换新的枪头，并将除盐枪头替换成富集小柱；更换一个新的储液槽，将平衡清洗液a、平衡清洗液b、第二洗脱液c以及第三洗脱液d转移到储液槽内，置于移液工作站内相应板位上；在移液工作站内依次放置7个96孔板，分别标注a1，a2，b1，b2，h2o，collection1,collection2；将装有步骤(14)中抽干的肽段的elute板置于移液工作站内；

51、(16)自动化工作站自动移液，向elute板中加入平衡清洗液a，吹打混匀复溶多肽样品；

52、(17)自动化工作站自动移液，向a1和a2板中，每孔加入平衡清洗液a，向b1和b2板中，每孔加入平衡/清洗液b，向h2o板中，每孔加入lc-ms水，向collection1板中加入洗脱液c，向collection2板中每孔加入洗脱液d；

53、(18)机械臂支配8通道排枪依次拾取富集小柱，先到达b1板位置，反复吹吸2次，平衡小柱，不弃去枪头；

54、(19)机械臂支配步骤(18)中的富集小柱，转移到a1板位置，反复吹吸2次，平衡小柱，不弃去枪头；

55、(20)机械臂支配步骤(19)中的富集小柱，转移到elute板位置，反复吹吸3次，使磷酸化肽于小柱中的填料结合，不弃去枪头；

56、(21)机械臂支配步骤(20)中的富集小柱，转移到a2板位置，反复吹吸3次，清洗掉没有结合上填料的多肽，不弃去枪头；

57、(22)机械臂支配步骤(21)中的富集小柱，转移到b2板位置，反复吹吸3次，清洗掉没有结合上填料的多肽，不弃去枪头；

58、(23)机械臂支配步骤(22)中的富集小柱，转移到h2o板位置，反复吹吸3次，清洗掉没有结合上填料的多肽，不弃去枪头；

59、(24)机械臂支配步骤(23)中的富集小柱，转移到collection1板位置，反复吹吸3次，洗脱并收集磷酸化肽；

60、(25)机械臂支配步骤(24)中的富集小柱，转移到collection2板位置，反复吹吸3次，洗脱并收集磷酸化肽；

61、(26)循环步骤(18)至步骤(25)直至所有样本都洗脱完毕；

62、(27)合并步骤(24)和(25)中的磷酸化肽，置于真空浓缩仪中抽干备用。

63、与现有技术相比，本发明具有如下所述的优点以及有益效果：

64、(1)本发明通过设计磷酸化肽段富集试剂盒以及与其配套的自动化高通量装置可以实现高效、高重复性的腹肌效果，并且其富集速度快、可以实现高通量样本富集。

65、(2)本发明基于自动化移液工作站及96孔板实现对大规模样品进行自动化磷酸化肽段富集，一方面大大提高了处理的样本通量，极大降低了样品处理时间和样本间的批次效应；另一方面，本发明始终以可调的吹吸/离心手段，保证了富集材料对样本的高度特异性富集；同时，富集的全过程都在富集小柱中完成，避免了样品转管造成的损失或降低富集的特异性。最后，本发明通过优化的前处理及富集溶液，使得实验周期明显缩短，一天内即可完成至少96个样本的磷酸化肽段富集过程。

66、(3)不仅本发明的自动化高通量装置其自动化程度高，并且基于磷酸化肽段富集试剂盒可实现快速酶解和高通量富集，相比于传统的蛋白提取和酶解过程至少需要24h，本案的流程仅需4小时即可完成，并且可一次完成96个样本的通量，磷酸化富集仅需1.5小时即可完成。同时，依靠优化的实验条件和溶液配方，在实现快速、高通量样本富集的同时，也能达到高效、高重复性的富集效果。因此，本发明所述的磷酸化肽段富集试剂盒可广泛用于磷酸化蛋白质组学研究中。