嗅觉受体在识别4-乙基愈创木酚中的用途和检测4-乙基愈创木酚的方法与流程

本发明涉及化学检测，具体地，本发明涉及一种嗅觉受体在识别4-乙基愈创木酚中的用途和检测4-乙基愈创木酚的方法，更具体地，本发明涉及一种嗅觉受体在识别4-乙基愈创木酚中的用途、4-乙基愈创木酚在激活嗅觉受体中的用途、检测4-乙基愈创木酚的方法、评估酱油产品品质的方法和判断酱油产品加工工艺的方法。

背景技术：

1、4-乙基愈创木酚，又名4-乙基-2-甲氧基苯酚，简称4-eg(4-ethylguaiacol，cas号2785-89-9)，为无色至淡黄色液体，微带酚的气息，通常被描述为一种酱香味、烟味和丁香味的物质，是一种天然的呈香化合物。

2、4-乙基愈创木酚的含量与酱油的品质密切相关，其不仅是酱油的主要香气成分，还具有缓和咸味的作用，1～5mg/l的4-乙基愈创木酚便可以明显改善酱油的风味品质。除此之外，4-乙基愈创木酚还是区别酱油高盐稀态发酵工艺和低盐固态发酵工艺酱油的关键香气成分。近年来，就有利用不同菌株混合培养或通过在发酵过程中添加菌株纯培养物的方式来提高酱油发酵工程中4-乙基愈创木酚含量的例子。

3、哺乳动物具有优异的嗅觉感知能力，可以灵敏快速地识别区分食物中的气味，其主要是因为气味剂可激活人的嗅觉受体(ors)触发神经冲动，将有关气味的信息传递到大脑。但是，目前尚未出现有关检测4-乙基愈创木酚的嗅觉受体的报道。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供了一种采用嗅觉受体检测4-乙基愈创木酚的方法，本发明的方法可快速识别出4-乙基愈创木酚，可用于辅助评估酱油的品质与风味。

2、在本发明的一个方面，本发明提出了一种嗅觉受体在识别4-乙基愈创木酚中的用途，所述嗅觉受体包括选自下列中的至少之一：mor170-15、mor179-7、mor125-5_p、mor106-4、or2w1、or2j2、or9q2和or10h3。发明人经过实验发现，用4-乙基愈创木酚分别刺激上述嗅觉受体后，上述嗅觉受体均可被激活，由此，可利用上述嗅觉受体有效地鉴定出4-乙基愈创木酚，为4-乙基愈创木酚的鉴定以及含有4-乙基愈创木酚的样品检测奠定基础。

3、需要说明的是，若4-乙基愈创木酚刺激嗅觉受体后，嗅觉受体被激活，即为“嗅觉受体可识别4-乙基愈创木酚”；若4-乙基愈创木酚刺激嗅觉受体后，嗅觉受体未被激活，即为“嗅觉受体不可识别4-乙基愈创木酚”。

4、在本发明的一个优选实施例中，所述嗅觉受体为mor170-15和/或mor179-7。

5、根据本发明的实施例，所述识别是通过嗅觉受体的活性变化体现的。

6、根据本发明的实施例，所述活性变化包括如下信号变化的至少之一：荧光素酶、分泌性碱性磷酸酶、荧光蛋白、荧光探针、camp、ip3、钙离子、电流和ph。

7、示例性地，所述识别是通过嗅觉受体下游的camp增加体现的。发明人经过实验发现，4-乙基愈创木酚刺激表达嗅觉受体的细胞，嗅觉受体被激活后，细胞内的camp浓度升高，通过检测camp浓度变化，即可确定嗅觉受体是否能够识别4-乙基愈创木酚。

8、在本发明的另一方面，本发明提出了一种4-乙基愈创木酚在激活嗅觉受体中的用途，所述嗅觉受体包括选自下列中的至少之一：mor170-15、mor179-7、mor125-5_p、mor106-4、or2w1、or2j2、or9q2和or10h3。发明人经过实验发现，用4-乙基愈创木酚分别刺激上述嗅觉受体后，上述嗅觉受体均可被激活，由此，可利用上述嗅觉受体有效地鉴定出4-乙基愈创木酚，为4-乙基愈创木酚的鉴定以及含有4-乙基愈创木酚的样品检测奠定基础。

9、在本发明的一个优选实施例中，所述嗅觉受体为mor170-15和/或mor179-7。

10、根据本发明的实施例，所述激活是通过嗅觉受体的活性变化体现的。

11、根据本发明的实施例，所述活性变化包括如下信号变化的至少之一：荧光素酶、分泌性碱性磷酸酶、荧光蛋白、荧光探针、camp、ip3、钙离子、电流和ph。

12、示例性地，所述识别是通过嗅觉受体下游的camp增加体现的。发明人经过实验发现，4-乙基愈创木酚刺激表达嗅觉受体的细胞，嗅觉受体被激活后，细胞内的camp浓度升高，通过检测camp浓度变化，即可确定嗅觉受体是否能够识别4-乙基愈创木酚。

13、在本发明的又一方面，本发明提出了一种检测4-乙基愈创木酚的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将待测样品与嗅觉受体接触，确定接触后所述嗅觉受体的响应值；基于所述响应值，确定所述待测样品中是否含有4-乙基愈创木酚；其中，所述嗅觉受体包括选自下列中的至少之一：mor170-15、mor179-7、mor125-5_p、mor106-4、or2w1、or2j2、or9q2和or10h3。由前可知，4-乙基愈创木酚可激活上述嗅觉受体，由此，将待测样品与上述嗅觉受体接触，若待测样品中含有4-乙基愈创木酚，上述嗅觉受体可被激活，并得到嗅觉受体激活后的响应值，根据响应值可确定待测样品中是否含有4-乙基愈创木酚。

14、需要说明的是，本文中的“接触”应做广义理解，可为直接接触，也可为间接接触，具体不受限制。

15、示例性地，通过液体状态的待测样品(本身为液体或采用溶剂制备成液体)和嗅觉受体混合后进行接触(即为待测样品和嗅觉受体进行直接接触)；也可为直接将待测样品和嗅觉受体放置于同一空间内，待测样品中自身释放的气味分子(4-乙基愈创木酚)与嗅觉受体进行接触(即为待测样品和嗅觉受体进行间接接触)。

16、在本发明的一个优选实施例中，所述嗅觉受体为mor170-15和/或mor179-7。

17、根据本发明的实施例，所述嗅觉受体存在响应值是所述待测样品中含有4-乙基愈创木酚的指示；或者，所述嗅觉受体不存在响应值是所述待测样品中不含有4-乙基愈创木酚的指示。

18、需要说明的是，“不含有4-乙基愈创木酚的指示”是指待测样品中完全不存在4-乙基愈创木酚；或者待测样品中存在少量的4-乙基愈创木酚，但不能被检测出来。

19、在本发明的一个实施例中，所述嗅觉受体选自mor170-15，所述嗅觉受体存在响应值是所述待测样品中含有4-乙基愈创木酚的指示或含有不低于3μm的4-乙基愈创木酚的指示；或者，所述嗅觉受体不存在响应值是所述待测样品中不含有4-乙基愈创木酚的指示或含有低于3μm的4-乙基愈创木酚的指示。

20、在本发明的一个实施例中，所述嗅觉受体选自mor179-7，所述嗅觉受体存在响应值是所述待测样品中含有4-乙基愈创木酚的指示或含有不低于10μm的4-乙基愈创木酚的指示；或者，所述嗅觉受体不存在响应值是所述待测样品中不含有4-乙基愈创木酚的指示或含有低于10μm的4-乙基愈创木酚的指示。

21、根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：基于标准曲线，确定所述待测样品中4-乙基愈创木酚的含量，所述标准曲线为预定量4-乙基愈创木酚与嗅觉受体响应值对应曲线。由此，可对待测样品中4-乙基愈创木酚的含量进行检测。

22、根据本发明的实施例，所述嗅觉受体是表达所述嗅觉受体的细胞或转基因细胞提供的。

23、根据本发明的实施例，所述细胞或转基因细胞为真核细胞或原核细胞。

24、在本发明的一些可选实施例中，所述真核细胞包括但不限于从嗅觉基板分离的细胞群组中选出的细胞、hek293细胞、cho细胞、爪蟾卵母细胞、hela细胞、cos细胞和酵母细胞等。

25、根据本发明的实施例，所述原核细胞选自细菌。

26、根据本发明的实施例，所述响应值是通过检测所述嗅觉受体的活性变化获得。

27、根据本发明的实施例，所述活性变化是通过如下检测方法的至少之一确定的：荧光素酶检测法、分泌性碱性磷酸酶检测法、荧光蛋白检测法、荧光探针检测法、ca2+浓度检测法、电流检测法、同位素标记法、抗体检测法和ph检测法。

28、示例性地，荧光素酶检测法的检测为，采用4-乙基愈创木酚或含有4-乙基愈创木酚的样品刺激含有嗅觉受体的细胞时，若嗅觉受体被激活，则细胞内camp浓度升高，camp结合cre-luciferase的启动子区，并促使荧光素酶的转录和翻译，因此，通过检测荧光素酶的活性，即可表征嗅觉受体的响应情况，确定嗅觉受体是否可识别4-乙基愈创木酚。

29、根据本发明的实施例，所述响应值是通过检测所述细胞中camp浓度的变化获得的。

30、示例性地，所述细胞中camp浓度的变化通过采用glosensortm camp检测试剂盒获得。glosensor-20f camp基因构建物可预先表达一种荧光素酶变体，camp浓度升高可引起荧光素酶变体的构象变化，使得荧光素酶从无活性状态转变为活性状态，glosensortmcamp检测试剂盒提供了荧光素酶变体的底物，该方法可实时测定camp的浓度变化，可快速、灵敏地检测待测样品中4-乙基愈创木酚的含量。

31、在本发明的又一方面，本发明提出了一种评估酱油产品品质的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将待测酱油产品与嗅觉受体接触，确定接触后所述嗅觉受体的响应值；基于所述响应值，确定所述待测酱油产品的品质；其中，所述嗅觉受体包括选自下列中的至少之一：mor170-15、mor179-7、mor125-5_p、mor106-4、or2w1、or2j2、or9q2和or10h3。由前可知，4-乙基愈创木酚可激活上述嗅觉受体，由此，将待测酱油产品与上述嗅觉受体接触，若待测酱油产品中含有4-乙基愈创木酚，上述嗅觉受体可被激活，并得到嗅觉受体激活后的响应值，根据响应值的大小可确定待测酱油产品的品质。

32、根据本发明的实施例，所述接触之前，预先将所述待测酱油产品进行稀释处理，稀释倍数为10～1000倍，例如为10～500倍、10～400倍、10～300倍、10～200倍、10～100倍、10～90倍、20～80倍、30～70倍等。

33、在本发明的一个优选实施例中，所述嗅觉受体为mor170-15和/或mor179-7。

34、根据本发明的实施例，所述响应值高于第一预定阈值，是待测酱油产品品质合格的指示。

35、在本文中，“预定阈值”可通过采用本发明的嗅觉受体对大量酱油产品(例如20种、50种、100种、150种、200种及以上)进行检测，基于大量酱油产品获得的响应值进行统计得到的。其中，“预定阈值”可为直接获得的响应值，可以为相对于对照组的相应倍数，具体类型不受限制。

36、需要说明的是，本领域技术人员可知，酱油发酵过程中如果产生4-乙基愈创木酚会显著提高酱油的品质，当酱油产品含有约1-2mg/l的4-乙基愈创木酚可明显改变酱油的品质，一般酱油产品中4-乙基愈创木酚的浓度不能超过5mg/l。基于此，第一预定阈值不低于6.5μm，当然该阈值可根据实际情况继续调整，第一预定阈值的设定范围为6.5μm-33μm，例如可为6.57μm-32.89μm、13.14μm-32.89μm、6.57μm-13.14μm中的任意点值。

37、示例性地，所述第一预定阈值约为6.57μm或13.14μm。

38、根据本发明的实施例，所述待测酱油产品的品质与所述响应值成正比。

39、在本发明的一些可选实施例中，将多个所述待测酱油产品分别与嗅觉受体接触，确定接触后所述嗅觉受体的响应值；基于所述响应值，确定所述待测酱油产品的品质，其中，所述响应值更高，是待测酱油产品的品质更高的指示。

40、示例性的，如图4所示，采用本发明的嗅觉受体对好记有机鲜酱油、李锦记味极鲜和金狮黄豆酱油的品质进行检测，有机鲜酱油的响应值>李锦记味极鲜的响应值>金狮黄豆酱油的响应值，因此，好记有机鲜酱油的品质最好，其次为李锦记味极鲜，最后为金狮黄豆酱油。

41、根据本发明的实施例，所述嗅觉受体是表达所述嗅觉受体的细胞或转基因细胞提供的。

42、根据本发明的实施例，所述细胞或转基因细胞为真核细胞或原核细胞。

43、在本发明的一些可选实施例中，所述真核细胞包括但不限于从嗅觉基板分离的细胞群组中选出的细胞、hek293细胞、cho细胞、爪蟾卵母细胞、hela细胞、cos细胞和酵母细胞等。

44、根据本发明的实施例，所述原核细胞选自细菌。

45、根据本发明的实施例，所述响应值是通过检测所述嗅觉受体的活性变化获得。

46、根据本发明的实施例，所述活性变化是通过如下检测方法的至少之一确定的：荧光素酶检测法、分泌性碱性磷酸酶检测法、荧光蛋白检测法、荧光探针检测法、ca2+浓度检测法、电流检测法、同位素标记法、抗体检测法和ph检测法。

47、示例性地，荧光素酶检测法的检测为，采用4-乙基愈创木酚或含有4-乙基愈创木酚的样品刺激含有嗅觉受体的细胞时，若嗅觉受体被激活，则细胞内camp浓度升高，camp结合cre-luciferase的启动子区，并促使荧光素酶的转录和翻译，因此，通过检测荧光素酶的活性，即可表征嗅觉受体的响应情况，确定嗅觉受体是否可识别4-乙基愈创木酚。

48、根据本发明的实施例，所述响应值是通过检测所述细胞中camp浓度的变化获得的。

49、示例性地，所述细胞中camp浓度的变化通过采用glosensortm camp检测试剂盒获得。glosensor-20f camp基因构建物可预先表达一种荧光素酶变体，camp浓度升高可引起荧光素酶变体的构象变化，使得荧光素酶从无活性状态转变为活性状态，glosensortmcamp检测试剂盒提供了荧光素酶变体的底物，该方法可实时测定camp的浓度变化，可快速、灵敏地检测待测样品中4-乙基愈创木酚的含量。

50、在本发明的又一方面，本发明提出了一种判断酱油产品加工工艺的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将待测酱油产品与嗅觉受体接触，确定接触后所述嗅觉受体的响应值；基于所述响应值，确定所述待测酱油产品的加工工艺；其中，所述嗅觉受体包括选自下列中的至少之一：mor170-15、mor179-7、mor125-5_p、mor106-4、or2w1、or2j2、or9q2和or10h3。由前可知，4-乙基愈创木酚可激活上述嗅觉受体，由此，将待测酱油产品与上述嗅觉受体接触，若待测酱油产品中含有4-乙基愈创木酚，上述嗅觉受体可被激活，并得到嗅觉受体激活后的响应值，根据响应值的大小可确定4-乙基愈创木酚的含量，进而判断酱油产品加工工艺。

51、根据本发明的实施例，所述加工工艺包括高盐稀态发酵工艺或低盐固态发酵工艺。本领域技术人员可知，4-乙基愈创木酚还是区别酱油高盐稀态发酵工艺和低盐固态发酵工艺酱油的关键香气成分，因此，采用本发明的方法，将待测酱油产品与上述嗅觉受体接触，若待测酱油产品中含有4-乙基愈创木酚，上述嗅觉受体可被激活，并得到嗅觉受体激活后的响应值，根据响应值的大小可确定4-乙基愈创木酚的含量，进而判断酱油产品加工工艺。

52、根据本发明的实施例，所述接触之前，预先将所述待测酱油产品进行稀释处理，稀释倍数为10～1000倍，例如可为10～500倍、10～400倍、10～300倍、10～200倍、10～100倍、10～90倍、20～80倍、30～70倍等。

53、在本发明的一个优选实施例中，所述嗅觉受体为mor170-15和/或mor179-7。

54、根据本发明的实施例，所述响应值高于第二预定阈值，是待测酱油产品是通过高盐稀态发酵工艺获得的指示。

55、根据本发明的实施例，第二预定阈值不低于1mg/l。

56、示例性地，第二预定阈值约为6.5μm。

57、根据本发明的实施例，所述嗅觉受体是表达所述嗅觉受体的细胞或转基因细胞提供的。

58、根据本发明的实施例，所述细胞或转基因细胞为真核细胞或原核细胞。

59、在本发明的一些可选实施例中，所述真核细胞包括但不限于从嗅觉基板分离的细胞群组中选出的细胞、hek293细胞、cho细胞、爪蟾卵母细胞、hela细胞、cos细胞和酵母细胞等。

60、根据本发明的实施例，所述原核细胞选自细菌。

61、根据本发明的实施例，所述响应值是通过检测所述嗅觉受体的活性变化获得。

62、根据本发明的实施例，所述活性变化是通过如下检测方法的至少之一确定的：荧光素酶检测法、分泌性碱性磷酸酶检测法、荧光蛋白检测法、荧光探针检测法、ca2+浓度检测法、电流检测法、同位素标记法、抗体检测法和ph检测法。

63、示例性地，荧光素酶检测法的检测为，采用4-乙基愈创木酚或含有4-乙基愈创木酚的样品刺激含有嗅觉受体的细胞时，若嗅觉受体被激活，则细胞内camp浓度升高，camp结合cre-luciferase的启动子区，并促使荧光素酶的转录和翻译，因此，通过检测荧光素酶的活性，即可表征嗅觉受体的响应情况，即可确定嗅觉受体是否可识别4-乙基愈创木酚。

64、根据本发明的实施例，所述响应值是通过检测所述细胞中camp浓度的变化获得的。

65、示例性地，所述细胞中camp浓度的变化通过采用glosensortm camp检测试剂盒获得。glosensor-20f camp基因构建物可预先表达一种荧光素酶变体，camp浓度升高可引起荧光素酶变体的构象变化，使得荧光素酶从无活性状态转变为活性状态，glosensortmcamp检测试剂盒提供了荧光素酶变体的底物，该方法可实时测定camp的浓度变化，可快速、灵敏地检测待测样品中4-乙基愈创木酚的含量。

66、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。