一种人乳特征脂肪酸指纹图谱及其在真实性鉴定中的应用

本发明属于食品分析，具体涉及一种人乳特征脂肪酸指纹图谱及其在真实性鉴定中的应用，在人乳的真实性鉴定应用中，将待测样品与标准人乳指纹图谱进行比对，可有效鉴定人乳样品的假冒或掺假。

背景技术：

1、乳是哺乳动物幼崽的基本膳食来源，能提供一系列对人类健康有益的营养素，包括脂质、蛋白、生物活性肽、矿物质、维生素等(liu et al.,2018)。我国乳制品种类丰富，除市场上常见的牛乳(荷斯坦牛乳、娟珊牛乳)，还有羊乳、水牛乳、牦牛乳等特色乳。与动物乳相比，人乳始终被认为是最有利于人类幼儿生长发育的食物。因此，人乳的营养价值研究成为乳制品营养品质评价的重要标杆，也是婴幼儿乳粉配方的参考依据。然而，由于目前伦理学的原因，人乳样本极难获得，这在一定程度上制约着与人乳相关的研究，如医学、生理学、食品科学、法医学等。在这种情况下，保证人乳样品的真实性尤为重要。动物乳假冒或掺杂到人乳中，将会对相关的科学研究和调查取证带来方向上的偏差。

2、目前，乳的真实性鉴定可以通过检测乳中蛋白质或基因实现。sharma等(2021)以乳中非免疫球蛋白抗原为指标，通过免疫方法能够鉴定水牛乳中低至5％的牛奶掺假。malo等(2018)以乳中免疫球蛋白为指标，通过免疫方法能鉴定山羊乳、绵羊乳、水牛乳中低至1％的牛奶掺假。liu等(2019)以乳中酪蛋白为指标，通过免疫方法能够对鉴定山羊乳中低至0.07％的牛奶掺假，而ren等(2014)也利用乳中酪蛋白鉴定出牦牛乳中低至1％的牛奶掺假。trimboli等(2019)通过毛细管电泳法检测乳中ɑ-乳白蛋白含量，以ɑ-乳白蛋白作为指标，能够对鉴定水牛乳中低至1％的牛奶掺假，并定量水牛乳中3.1％以上的掺假水平。chen等(2016)基于蛋白质组学的方法，以β-乳球蛋白作为指标，能定性定量分析山羊乳或绵羊乳中掺杂的牛乳。de等(2011)以线粒体dna环状片段为目标序列，利用pcr技术分别扩增出牛乳和水牛乳的126bp和226bp特异性pcr产物，利用物种特异性dna序列，能够鉴定水牛乳中低至0.01％的牛奶掺假。但是，乳制品的均质和热处理等加工过程对蛋白质和基因的破坏性大，乳中蛋白质含量变化范围广、干扰因素多。因此，基于蛋白质特征对物种差异的鉴定方法灵敏度较低，易产生假阳性结果，而基于物种的基因差异的鉴定方法虽然具有较高的灵敏度，但费时且昂贵，应用门槛高，较难普及。

3、另外，乳品真实性鉴定也可以通过乳中特定营养成分的聚类分析来实现。pereira等(2020)基于近红外光谱法测定牛奶和山羊奶中脂肪和蛋白质的总含量，建立pls-da模型能够鉴定山羊奶中添加含量低至1.0154g/100g的牛奶。sen等(2021)基于傅立叶变换红外光谱法测定牛奶、水牛奶和山羊奶的脂肪、蛋白质、乳糖和非脂肪固体总含量，建立opls-da模型能对混合水平高于5％的牛奶-山羊奶和牛奶-水牛奶两类牛奶混合物进行鉴定，判别分析的正确率分别为93％和91％。张鑫等(2018)基于气相色谱法测定牛奶、马奶的脂肪酸含量，采用pca、simca和pls模型对牛奶和马奶的混合样品分析，阐明脂肪酸指纹图谱对特色乳真实性鉴定的可行性，能对马乳中低至10％的牛奶掺假进行鉴定。

4、生乳中脂肪酸种类丰富，不同物种生乳中脂肪酸的组成和含量差异巨大。脂肪酸指纹图谱是指乳中所有脂肪酸的组成概况及含量特征，作为物种差异性或特异性的识别技术，应用于乳品真实性鉴定更为准确、可靠。但是，目前脂肪酸的测定结果多以相对含量的形式呈现，这要求对乳中所有脂肪酸进行面积归一化定量(liu et al.,2018)，大幅增加了分析时间。而选择特征脂肪酸比值不仅可以简化分析过程，提高真实性鉴定的效率，而且显现出差异最大化，提高真实性鉴定的准确性。研究发现，c10:0/c8:0,c12:0/c10:0,c14:0/c12:0和c14:0/c18:1脂肪酸比值能判别乳脂中掺入牛油和猪油(anmat,2011)，但是，rebechi等(2016)该方法仅能鉴定乳脂中掺入含量15％以上的牛油或猪油，检测灵敏度不足。

5、上述方法在一定程度上能够实现乳品掺假的鉴定，但将其应用于人乳真实性鉴定存在一定局限性，如测定前需进行分离、提取等预处理，导致操作繁琐、操作时间长、分析费用高、灵敏度低、应用性差等。现有技术的人乳真实性鉴定方法研究较少，并且没有针对人乳真实性的适用性和可追溯性强的真实性鉴定方法。因此，一种能够准确鉴别人乳及其制品的真实性、操作简便、适用性和可追溯性强的人乳真实性鉴定方法亟需开发出来。

技术实现思路

1、为了克服现有技术中存在的乳制品真实性鉴定方法滞后，并且没有针对人乳真实性鉴定的适用性和可追溯性强的鉴定方法的问题。本发明的目的在于提供一套人乳中特征脂肪酸比值的特征范围，根据上述特征脂肪酸比值的特征范围构建一种人乳的指纹图谱，并将其应用于人乳及相关产品的真实性鉴定。

2、本发明的发明思路为：与牛乳、水牛乳、牦牛乳、羊乳、驴乳、骆驼乳等动物乳相比，人乳中的la、dha、c20:1c11等脂肪酸的含量较高，而c8:0、c15:0、c15:0anteiso、c14:1c9、cla等脂肪酸的含量较低。本发明利用前期研究的大量实验积累和背调大数据，对各种脂肪酸比值进行统计与筛选，筛选出几种在人乳中数值极小，且与其他动物乳差别较大的作为特征脂肪酸比值。对每一个特征脂肪酸比值，采用avg(平均值)±3×sd(标准偏差)的方式计算在人乳中的特征范围，置信度达99％，制作雷达图形成指纹图谱。将待测乳样的特征脂肪酸比值测定计算，然后与上述指纹图谱进行比对，以进行真实性鉴定。

3、本发明具体的技术方案如下：

4、一种人乳特征脂肪酸指纹图谱，所述的人乳特征脂肪酸为：c8:0、c14:1cis-9、c15:0、c15:0anteiso、c18:2c9t11(cla)、c18:2c9c12(la)、c20:1cis-11、c22:6c4c7c10c13c16c19(dha)。

5、一种人乳特征脂肪酸指纹图谱，基于人乳中c8:0/la、c8:0/dha、c14:1cis-9/c20:1cis-11、c15:0/dha、c15:0anteiso/c20:1cis-11、cla/la 6个脂肪酸比值构建标准人乳指纹图谱，所述的特征脂肪酸的比值范围为：

6、

7、

8、一种应用上述人乳特征脂肪酸指纹图谱的人乳真实性鉴定方法，包括以下步骤：

9、s1:测定待测试样中的特征脂肪酸含量，计算相应的人乳特征脂肪酸比值；

10、s2:将步骤s1计算得到的相应脂肪酸比值与人乳特征脂肪酸指纹图谱进行比对，当任意一项特征脂肪酸比值超出特征范围，即在雷达图置信范围之外，则判定为样品不完全为人乳，存在假冒或掺假。

11、优选的，步骤s1所述的测定待测人乳试样中的特征脂肪酸含量利用气相色谱法或气相色谱-质谱联用法测定。

12、优选的，步骤s1所述的计算相应的脂肪酸比值结果以相对值(％总脂肪酸)计。

13、优选的，步骤s1所述的计算相应的脂肪酸比值结果以绝对值(mg/l乳)计。

14、与现有技术相比，本发明所具备的有益效果：

15、(1)指纹特征性(排他性)：本发明中选择的特征脂肪酸比值具有明显的指纹特征性。相比其他动物乳，上述比值均为极小值。6项指标从多个维度进行判断，能够快速准确的区分其他动物乳。

16、(2)简单快捷：与测定蛋白或核酸等免疫方法相比，脂肪酸含量的测定更加简单，4～6小时可完成测定。更重要的是，脂肪酸作为基本的营养指标，属于乳样的常测指标，因此仅需要用本方法对已有检测结果进行分析即可得到人乳真实性鉴定的结论。

17、(3)适用性强：与测定蛋白或核酸等免疫方法相比，脂肪酸含量的测定技术门槛不高，成本较低。其结果可以由气相色谱法或气相色谱-质谱联用法测定，也可以由红外快速测定装置获得。

18、(4)追溯性强：使用本发明的基于特征脂肪酸指纹图谱的人乳真实性鉴定方法能够通过数据进行判定，对历史数据、文献数据等都可以进行无样品判定。