一种分子印迹传感器的制备方法及应用

本发明涉及新冠n蛋白特异性检测，具体是涉及一种分子印迹传感器的制备方法及应用。

背景技术：

1、新型冠状病毒除了在人群中传播外，病毒还会通过污染物间接传播，在环境样本中检出新冠病毒的案例也越来越多，环境间的传播已成为新冠病毒的另一种新形式。因此，对环境这种新冠病毒的检测至关重要，可以提供早期预警。

2、核酸检测是当前新冠病毒检测的主要手段，是目前新冠病毒检测的“金标准”，但存在操作复杂、成本高、费时等问题。酶联免疫具有实验操作简单、特异性高等特点，但这类方法存在费时、易受干扰、不适用于早期诊断。核酸和抗体检测主要用于临床，且价格昂贵、需要专业的技术人员。环境中物质复杂、影响因素较多，导致这些方法的可用性降低。因此，开发一种易操作、简便和准确性高的检测方法对环境中新冠病毒的检测具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于制备一种具有操作简单、灵敏度高、准确性高的分子印迹传感器，用于环境中新冠病毒的快速检测，该传感器可重复使用。

2、为解决上述问题，本发明的技术方案如下：

3、一种分子印迹传感器的制备方法，包括以下步骤：

4、s1、制备多壁碳纳米管分散液：

5、将1mg的羧基化多壁碳纳米管分散在1ml有机溶剂n’n二甲基甲酰胺溶液中，再加入粘结剂，超声分散配制成碳纳米管分散液；

6、s2、玻碳电极预处理：

7、依次使用0.3nm、0.1nm、0.5nm的三氧化二铝抛光粉打磨玻碳电极，并在每次打磨结束后依次通过乙醇、超纯水对玻碳电极进行超声清洗，以清洗掉残留在电极表面的三氧化二铝粉末，得到打磨后的玻碳电极，采用滴涂法将步骤s1所制备的羧基化多壁碳纳米管分散液均匀滴涂在打磨后的玻碳电极上，室温晾干，得到预处理后的玻碳电极；

8、s3、配置吡咯溶液：

9、将3ul吡咯单体加入到含0.1m kcl的3997ul的pbs磷酸盐缓冲溶液中配制得到吡咯溶液；

10、s4、制备新冠n蛋白印迹修饰电极：

11、将新冠n蛋白作为模板分子加入到步骤s3所制备的吡咯溶液中，得到新冠n蛋白浓度为10ng/ml的吡咯溶液，再将吡咯溶液在4℃冰箱中孵育10～20min后，在-0.2～1.0v的电压下，将吡咯溶液在循环伏安法下进行17个循环以完成玻碳电极的修饰，循环的扫描速率为100mv/s，得到新冠n蛋白印迹修饰电极，此时新冠n蛋白印迹修饰电极表面具有含新冠n蛋白修饰的聚吡咯薄膜；

12、s5、制备含有新冠n蛋白印迹空穴的分子印迹传感器：

13、将步骤s4得到的新冠n蛋白印迹修饰电极浸入酸溶液中孵育后用去离子水充分清洗，去除嵌在聚吡咯薄膜中的新冠n蛋白质，干燥后得到含有新冠n蛋白印迹空穴的分子印迹传感器。

14、进一步地，步骤s1中，粘结剂为全氟磺酸基聚合物溶液，粘结剂的体积为10ul，粘结剂中全氟磺酸基聚合物的质量百分数为0.05％，超声的时间为30～60min。

15、进一步地，步骤s2中的的直径为3～5mm，长度为70～80mm，羧基化碳纳米管分散液的滴涂量为5～10ul，步骤s3中，吡咯溶液中吡咯单体浓度为10mm，超声清洗的时间为30～60min，步骤s4中，孵育的条件为静止放置。

16、进一步地，步骤s3中pbs磷酸盐缓冲溶液的制备方法为：

17、将71.6g的na2hpo4和31.2g的nah2po4分别溶于1000ml超纯水中，得到na2hpo4溶液和nah2po4溶液，将na2hpo4溶液和nah2po4溶液按照81:19的体积比混合得到pbs磷酸盐缓冲溶液，pbs磷酸盐缓冲溶液的ph值为7.0。

18、更进一步地，酸溶液为1m的硫酸溶液，孵育为在室温下对浸入酸溶液的新冠n蛋白印迹修饰电极进行震荡，震荡的速度为180r/min，震荡的时间为30～60min。

19、本发明还提供了一种分子印迹传感器的应用，基于上述的种分子印迹传感器的制备方法得到的分子印迹传感器，通过新冠蛋白印迹传感器吸附新冠n蛋白溶液，建立新冠病毒n蛋白与电化学信号之间的线性关系。

20、上述应用具体包括以下步骤：

21、s1、分别配制浓度为0.01、0.05、0.075、0.1、0.15、0.3ng/ml、体积为1～3ml的新冠n蛋白溶液，将新冠蛋白印迹传感器分别置于上述溶液中1～40min；

22、s2、取出新冠蛋白印迹传感器后用去离子水充分清洗，晾干后置于1mm的k3[fe(cn)6]/k4[fe(cn)6]含1m kcl溶液中；

23、s3、使用电化学工作站的差分脉冲伏安法分析吸附前后的电流峰值，建立新冠病毒n蛋白与电化学信号之间的线性关系，差分脉冲伏安法采用电位范围为0～0.6v，脉冲幅值为0.004v，脉冲宽度0.05s，脉冲周期0.5s。

24、本发明还提供了一种分子印迹传感器的应用，基于上述的种分子印迹传感器的制备方法得到的分子印迹传感器，将新冠n蛋白印迹传感器置于同浓度的包括新冠n蛋白的多种动物蛋白质的溶液中，根据测得的电流信号强度得出新冠n蛋白印迹的选择性。

25、说明：上述应用具体包括以下步骤：

26、s1、分别配制浓度为0.01～0.3ng/ml、体积为1～3ml的包括新冠n蛋白的多种动物蛋白质的溶液，作为孵育溶液；

27、s2、分别向上述孵育溶液中置入一个分子印迹传感器并孵育1～40min后，取出分子印迹传感器后用去离子水充分清洗，孵育为：在室温下振荡，振荡速度为180～200r/min；

28、s3、将步骤s2处理后的分子印迹传感器置于1mm的k3[fe(cn)6]/k4[fe(cn)6]溶液中含1m kcl溶液，使用电化学工作站测量各个分子印迹传感器的差分脉冲伏安电流，采用电位范围为0～0.6v，脉冲幅值为0.004v，脉冲宽度0.05s，脉冲周期0.5s，记录分子印迹传感器与上述孵育溶液孵育后的电流响应信号强度。

29、本发明还提供了一种分子印迹传感器的应用，基于上述的种分子印迹传感器的制备方法得到的分子印迹传感器，将新冠n蛋白溶液中加入水环境中的干扰物，再将新冠n蛋白印迹传感器置于混合溶液中，通过电信号强度的检测结果得到新冠n蛋白印迹传感器的抗干扰性。

30、说明：干扰物包括葡萄糖、腐殖酸、dna。

31、上述应用具体包括以下步骤：

32、s1、分别向浓度为0.01～0.3ng/ml、体积为1～3ml的新冠n蛋白溶液中加入干扰物，得到多种干扰溶液；

33、s2、分别向上述干扰溶液中置入一个分子印迹传感器并孵育1～40min后，取出分子印迹传感器后用去离子水充分清洗，孵育为：在室温下振荡，振荡速度为180～200r/min；

34、s3、将步骤s2处理后的分子印迹传感器置于1mm的k3[fe(cn)6]/k4[fe(cn)6]溶液中含1m kcl溶液，使用电化学工作站测量该传感器差分脉冲伏安电流，采用电位范围为0～0.6v，脉冲幅值为0.004v，脉冲宽度0.05s，脉冲周期0.5s，记录分子印迹传感器与干扰溶液孵育后的电流响应信号强度。

35、本发明还提供了一种分子印迹传感器的应用，分别将通过过滤膜的污水处理厂的进水和出水中加入新冠n蛋白溶液并充分混合，得到进水混合液和出水混合液，再分别将新冠n蛋白印迹传感器置于进水混合液和出水混合液中孵育后，通过电信号强度的检测结果得到新冠n蛋白印迹传感器的抗干扰性。

36、说明：上述应用具体包括以下步骤：

37、s1、分别将浓度为0.01～0.3ng/ml的新冠n蛋白溶液加入到通过0.22um过滤膜的污水处理厂的进水和出水中充分混合，得到体积为1～3ml的进水混合液和出水混合液；

38、s2、分别向上述进水混合液和出水混合液中置入一个分子印迹传感器并孵育1～40min后，取出分子印迹传感器后用去离子水充分清洗，孵育为：在室温下振荡，振荡速度为180～200r/min；

39、s3、将步骤s2得到的分子印迹传感器置于1mm的k3[fe(cn)6]/k4[fe(cn)6]溶液中含1m kcl溶液中，使用电化学工作站测量该传感器差分脉冲伏安电流，采用电位范围为0～0.6v，脉冲幅值为0.004v，脉冲宽度0.05s，脉冲周期0.5s，记录该传感器与含n蛋白的进出水孵育后的电流响应信号强度。

40、本发明的有益效果是：

41、本发明提供的蛋白印迹传感器对环境中的新冠病毒具有较高的灵敏度，在0.01～0.15ng/ml的新冠n蛋白溶液中所产生的电信号与浓度之间具有良好的线性关系。本发明制备的n蛋白印迹传感器灵敏度高于常规的核酸检测方法，在新冠n蛋白浓度为10-9ng/ml范围内仍然有良好的信号响应，新冠n蛋白印迹传感器对新冠n蛋白具有良好的选择性，能抵抗环境中干扰物的影响。