一种蛋白传感阵列及其制备方法和应用与流程

本发明属于生化传感，具体涉及一种蛋白传感阵列及其制备方法和应用。

背景技术：

1、蛋白质的准确鉴定对蛋白质组学研究、临床诊断和生物医学研究都至关重要。灵敏、便捷、准确的蛋白质检测方法为这些领域的发展提供了重要工具。然而，由于目标分析物的结构多样性和复杂性，蛋白质检测是一个具有挑战性的问题。目前，最广泛使用的蛋白质检测方法是酶联免疫吸附试验(elisa)。在该系统中，固定在表面上的捕获抗体通过“锁键”方法与抗原结合，另一种酶偶联抗体与显色底物或荧光底物反应产生可检测的信号。尽管该方法具有较高的灵敏度，但由于其生产成本高、不稳定性和定量方面的缺陷，限制了该方法的应用。

2、“化学鼻”方法为使用独有的分析物/受体结合的检测方法提供了一种替代方案。在这种策略中，采用具有选择性受体的传感器阵列，而不是“锁键”特异性识别用于分析物检测。在策略上，该阵列能够呈现化学多样性，以便对各种不同的分析物作出不同的反应。在过去几年中，这种方法已被广泛用于检测的多种分析物，包括金属离子、挥发性试剂、芳香胺、氨基酸、蛋白质和细菌等。

3、cn110632149b公开了一种用于甲胎蛋白检测的电化学传感器及其制备方法和应用。所述电化学传感器以玻碳电极为基底，所述玻碳电极上修饰有碳纳米管-甲胎蛋白适体复合物，所述碳纳米管为表面具有活性末端和非活性末端的碳纳米管，所述甲胎蛋白适体与碳纳米管上的活性末端连接形成碳纳米管-甲胎蛋白适体复合物；所述修饰有碳纳米管-甲胎蛋白适体复合物的玻碳电极上捕获有甲胎蛋白，从而实现对甲胎蛋白的检测。

4、cn103336112a公开了一种灵敏度高、快速准确，可实现快速测定人免疫球蛋白e(hige)的检测方法，所述方法通过构建一种碳纳米管微悬臂梁生物传感器来实现。该生物传感器包括支架、基底材料、碳纳米管、拾取电路，在碳纳米管上面还修饰有一层核酸适配体。先在碳纳米管微悬臂梁上制作含有hige核酸适配体的检测探针，检测时，将检测探针放入待测样本中，待测样本中的hige通过特异性反应与检测探针上的核酸适配体形成复合物并附着在微悬臂梁上；该复合物在微悬臂上产生的质量变化引起微悬臂梁挠曲位移或谐振频率的变化，根据两者变化的关系和该复合物的质量大小与待测样本中hige的浓度呈正相关，从而实现对hige的检测。

5、但是目前现有的基于碳纳米管的电化学传感器能检测的蛋白种类有限，因此，开发一种能够广泛适用、检测蛋白种类多的基于碳纳米管的电化学传感器具有重要的应用价值。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种蛋白传感阵列及其制备方法和应用。本发明利用碳纳米管与生物靶标之间的非特异性弱相互作用，获得较好的传感探针群组，进一步通过数据分析，建立多种蛋白的模式识别策略。所述蛋白传感阵列能同时检测多种分析物，同时具有较高的灵敏度和选择性。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种蛋白传感阵列，所述蛋白传感阵列包括一组ensaptamer元件，所述ensaptamer元件由第一dna-swcnts杂化分子溶液、第二dna-swcnts杂化分子溶液和第三dna-swcnts杂化分子溶液组成；

4、所述dna-swcnts杂化分子为单链dna序列缠绕的单手性碳纳米管；

5、所述第一dna-swcnts杂化分子中dna的序列如seq id no:1所示，所述第一dna-swcnts杂化分子中单手性碳纳米管的手性指数为(7,3)；

6、所述第二dna-swcnts杂化分子中dna的序列如seq id no:1所示，所述第二dna-swcnts杂化分子中单手性碳纳米管的手性指数为(6,5)；

7、所述第三dna-swcnts杂化分子中dna的序列如seq id no:2所示，所述第三dna-swcnts杂化分子中单手性碳纳米管的手性指数为(8,3)。

8、优选地，所述第一dna-swcnts杂化分子溶液中第一dna-swcnts杂化分子的od1020nm值为1.0-1.5；溶剂为水。

9、优选地，所述第二dna-swcnts杂化分子溶液中第二dna-swcnts杂化分子的od990nm值为1.0-1.5；溶剂为水。

10、优选地，所述第三dna-swcnts杂化分子溶液中第三dna-swcnts杂化分子的od978nm值为1.0-1.5；溶剂为水。

11、优选地，所述第一dna-swcnts杂化分子、第二dna-swcnts杂化分子和第三dna-swcnts杂化分子采用包括如下步骤的方法制备得到：

12、(a)将葡聚糖、聚乙二醇和水配制成溶液一，静置分层，分别获取空白上相和空白下相；

13、(b)将单壁碳纳米管、dna、nacl和水配制成溶液二，将所述溶液二在冰水浴中超声分散，再离心收集上清，得到dna-swcnts分散液；

14、(c)将葡聚糖、聚乙二醇、水和所得dna-swcnts分散液配制成溶液三；向溶液三中加入调节剂，调控dna-swcnts在体系中的分配，选择相应的上相或下相进行后续分离，分别得到第一dna-swcnts杂化分子、第二dna-swcnts杂化分子和第三dna-swcnts杂化分子。

15、本发明采用双水相分离法成功分离了三种具有特异性识别作用的dna-swcnts杂化分子，所述dna-swcnts杂化分子表面具有较高的表面电荷密度，dna在swcnt表面具有较大的包裹程度和吸附强度。

16、优选地，步骤(a)中，所述溶液一中葡聚糖的浓度为8-10％，聚乙二醇的浓度为7-10％。

17、优选地，步骤(a)中，所述葡聚糖的分子量为200-250kda，所述聚乙二醇的分子量为1-1.5kda。

18、优选地，步骤(a)中，所述静置的时间为8-12h，所述静置的温度为20-25℃。

19、优选地，步骤(b)中，所述溶液二中单壁碳纳米管的浓度为0.8-1.2mg/ml，dna的浓度为1.5-2.5μg/μl，nacl的浓度为25-35mm。

20、优选地，步骤(b)中，所述超声分散的时间为2-3h。

21、本发明中，步骤(b)中，所述离心的时间为90-100min，所述离心的离心力11000-12000g。

22、优选地，步骤(c)中，所述溶液三中葡聚糖的浓度为8-10％，聚乙二醇的浓度为7-10％，所述dna-swcnts分散液的体积为溶液三总体积的25-30％。

23、优选地，步骤(c)中，所述调节剂选自聚乙烯吡咯烷酮、pbs或聚乙二醇。

24、优选地，所述聚乙烯吡咯烷酮的分子量为8-10kda。

25、优选地，所述聚乙二醇的分子量为1-1.5kda。

26、本发明中分离得到第一dna-swcnts杂化分子、第二dna-swcnts杂化分子和第三dna-swcnts杂化分子后，还包括采用硫氰酸钠对得到的dna-swcnts杂化分子进行除杂纯化的步骤。

27、本发明中，所述除杂纯化的步骤包括：将硫氰酸钠水溶液分别与所述dna-swcnts杂化分子溶液涡旋混合，离心收集沉淀，重悬得到相应水溶液，再进行超滤。

28、本发明中，所述硫氰酸钠水溶液中的硫氰酸钠浓度为1-6m。

29、本发明中，所述硫氰酸钠水溶液与dna-swcnts杂化分子溶液的体积比为1:(0.8-1.2)。

30、本发明中，所述离心的离心力16000-17000g，所述离心的时间为25-30min。

31、本发明中，所述超滤采用的超滤膜的分子截流量为3000da以上。

32、优选地，分离第一dna-swcnts杂化分子和第二dna-swcnts杂化分子时的分离步骤为：

33、(1)向溶液三中加入调节剂，对混合后的体系依次进行涡旋、离心，分别收集溶液中的上相一和下相一；从所述上相一中分离第一dna-swcnts杂化分子；

34、(2)向所述下相一中加入调节剂和空白上相，对混合后的体系依次进行涡旋、离心收集溶液中的下相二；

35、(3)重复步骤(2)直到得到下相八；

36、(4)向所述下相八中加入调节剂和空白上相，对混合后的体系依次进行涡旋、离心，收集溶液中的下相九；

37、(5)向所述下相九中加入调节剂和空白上相，对混合后的体系依次进行涡旋、离心，收集溶液中的下相十；

38、(6)重复步骤(5)直到得到上相十一，从所述上相十一中分离第二dna-swcnts杂化分子。

39、优选地，步骤(1)中，所述溶液三与调节剂的体积比为610:(0.45-0.55)。

40、优选地，步骤(1)中，所述调节剂为浓度为8-12％的聚乙烯吡咯烷酮溶液。

41、优选地，步骤(2)中，所述下相一、调节剂和空白上相的体积比为1:(0.006-0.007):(0.8-1.2)。

42、优选地，步骤(2)中，所述调节剂为浓度为18-22％的聚乙烯吡咯烷酮溶液。

43、优选地，步骤(4)中，所述下相八、调节剂与空白上相的体积比为1:(0.003-0.004):(0.8-1.2)。

44、优选地，步骤(4)中，所述调节剂为浓度为18-22％的聚乙烯吡咯烷酮溶液。

45、优选地，步骤(5)中，所述下相九、调节剂与空白上相的体积比为1:(0.003-0.004):(0.8-1.2)。

46、优选地，步骤(5)中，所述调节剂为浓度为8-12％的聚乙烯吡咯烷酮溶液。

47、优选地，分离第三dna-swcnts杂化分子时的分离步骤为：

48、(1)向溶液三中加入调节剂，对混合后的体系依次进行涡旋、离心，收集溶液中的下相一；

49、(2)向所述下相一中加入调节剂和空白上相，对混合后的体系依次进行涡旋、离心收集溶液中的上相二；

50、(3)将所得上相二进行静置，离心得到的上相三，从所述上相三中分离第三dna-swcnts杂化分子。

51、优选地，步骤(1)中，所述溶液三与调节剂的体积比为610:(0.8-1.2)。

52、优选地，步骤(1)中，所述调节剂为浓度为18-22％的聚乙烯吡咯烷酮溶液。

53、优选地，步骤(2)中，所述下相一、聚乙二醇溶液和空白上相的体积比为1:(0.025-0.035):(0.8-1.2)。

54、优选地，步骤(2)中，所述聚乙二醇溶液中聚乙二醇的浓度为55-65％。

55、第二方面，本发明提供第一方面所述的蛋白传感阵列的使用方法，所述使用方法包括：

56、(1)分别测定第一dna-swcnts杂化分子溶液、第二dna-swcnts杂化分子溶液和第三dna-swcnts杂化分子溶液的近红外荧光强度；

57、(2)向第一dna-swcnts杂化分子溶液、第二dna-swcnts杂化分子溶液和第三dna-swcnts杂化分子溶液中加入待测蛋白，分别测定加入待测蛋白后的溶液的近红外荧光强度；采用同样的方法测定标准蛋白的近红外荧光强度；

58、(3)根据标准蛋白和待测蛋白对应的近红外荧光强度变化判断待测蛋白的种类。

59、本发明采用分离的具有特异性识别作用的dna-swcnts杂化分子构建了蛋白传感器阵列，所述蛋白传感器阵列的检测准确度高，能够对多种样品进行准确检测。

60、优选地，步骤(1)和(2)中，测定近红外荧光强度时，激发波长为512nm、575nm、679nm，发射波长1020nm、1002nm、9700nm。

61、优选地，所述待测蛋白在检测体系中的终浓度为100-1000nm。

62、第三方面，本发明提供第一方面所述的蛋白传感阵列在蛋白检测中的应用。

63、本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

64、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

65、(1)本发明采用双水相分离法成功分离了三种具有特异性识别作用的dna-swcnts杂化分子，所述dna-swcnts杂化分子表面具有较高的表面电荷密度，dna在swcnt表面具有较大的包裹程度和吸附强度；

66、(2)本发明采用分离的具有特异性识别作用的dna-swcnts杂化分子构建了蛋白传感器阵列，所述蛋白传感器阵列的灵敏度/选择性可以很容易地通过改变表面化学进行改变，例如通过使用不同的dna序列来修改。所述蛋白传感器阵列的检测准确度高，能够对多种样品进行准确检测。