基于高分辨生物活性谱对杭白菊舒缓抗衰成分的筛选方法

本发明涉及中药分析，具体涉及一种结合高分辨生物活性谱和uplc-esi-qtof-ms/ms鉴定杭白菊舒缓抗衰成分的方法。

背景技术：

1、杭白菊(chrysanthemummorifolium，hbj)是我国传统药用植物菊花(chrysanthemummorifoliumramat.)中的一种栽培品种，具有独特的感官特性和多种活性成分，临床以抗炎和改善心血管功能异常作用突出，其功能特性已在细胞、动物和人体中得到证实。目前基于uplc-esi-qtof-ms/ms技术对杭白菊中生物活性成分的系统研究较少，且以往研究仅局限于菊花中一类生物活性成分，尚缺乏多类型生物活性成分同时进行准确筛查鉴定的方法研究。因此，基于杭白菊主要药效作用，精确定位生物活性化合物，详细分离与解析多类型生物活性成分方法，开发一种满足功效筛选需求且活性成分鉴定的方法意义重大。

2、目前，国内外报道杭白菊及杭白菊制品定性和定量检测方法均趋向于靶向性分析，且粗提物中的活性成分更为复杂多样，各成分之间干扰严重。

技术实现思路

1、针对杭白菊现有功效成分筛选方法的不足，本发明提供了基于高分辨生物活性谱联合uplc-esi-qtof-ms/ms的方法来高效全面的识别分离杭白菊活性成分，并进一步筛选杭白菊中舒缓成分的方法，本发明为杭白菊的功效物质基础研究提供科学有效的方法。

2、本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

3、基于高分辨生物活性谱对杭白菊舒缓抗衰成分的筛选方法，包括如下步骤：

4、(1)样品的分析

5、将待测样品粉末进行回流提取，提取物干燥粉碎得到提取物粉末；

6、以40～80％甲醇对粗提取物进行复溶，超声溶解，所得提取物溶液利用高效液相色谱进行检测，得到样品色谱图；

7、所述的待测样品粉末为干燥杭白菊粉碎后，过50～100目筛；

8、所述的杭白菊样品回流提取样品与提取溶液的质量比为：1:10～40；

9、所述的杭白菊样品回流提取样品提取时间为：1～5h；

10、所述的杭白菊样品回流提取样品提取次数为：1～6次；

11、所述的杭白菊样品提取回流溶液为50％乙醇；

12、所述的高效液相色谱仪的色谱条件为：

13、色谱柱为ultimatelp-c18，柱高250mm，内径4.6mm，粒度5μm；柱温20～40℃；流速0.3～3ml/min；检测波长348nm；流动相比例，a相乙腈，b相0.1％甲酸水。

14、(2)舒缓抗衰活性的测定

15、精密称取杭白菊的粗提物，用甲醇配制杭白菊粗提物溶液，将粗提物溶液在步骤(1)中的高效液相色谱条件下分析，收集液相馏出液后挥干得到馏分；通过体外透明质酸酶抑制活性实验测定杭白菊hplc分离馏分对透明质酸酶的抑制作用，并通过软件绘制样品馏分的色谱保留时间与抑制率的曲线，得到高分辨透明质酸酶抑制活性曲线；通过dpph自由基清除实验测定杭白菊hplc馏分的抗氧化活性，并用绘图软件作样品的保留时间与清除率的曲线，得到高分辨自由基清除曲线；

16、所用hplc色谱采集数据的原始数据文件，转换并保存为dif格式文件；

17、(3)高分辨生物活性谱的构建

18、结合hplc色谱图和高分辨透明质酸酶抑制、自由基清除曲线，以保留时间为基准，使hplc色谱出峰与一种或多种待测生物活性成分直接关联，建立杭白菊的高分辨生物活性谱；

19、(4)uplc-esi-qtof-ms/ms对潜在活性成分的鉴定

20、通过高分辨生物活性谱筛选杭白菊样品中潜在的舒缓抗衰活性成分；精密称取杭白菊的粗提物，用甲醇配制杭白菊粗提物溶液，进行超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱分析；

21、超高效液相色谱的条件为：色谱柱，xbridge-c18柱，5μm，250mm×4.6mm；柱温，30℃；流速，0.5-2ml/min；紫外检测波长，348nm；流动相，乙腈(a)-0.1％甲酸水(b)；

22、质谱条件为：在负离子模式下检测，雾化气压(n2)40～80psi，辅助气压(n2)40～80psi，气帘气压(n2)20～70psi；离子源温度，550℃；喷雾电压-4.5kv。tof-ms参数：去簇电压-80v，碰撞能-10v，质量扫描范围100～1000，累积时间0.25s。ida参数：最大候选离子数6；触发二级碎裂扫描的离子强度阈值10cps。tof-ms/ms参数：去簇电压-80v，碰撞能-30v，质量扫描范围50～1000，累积时间0.1s。

23、结合步骤(1)中的高效液相色谱条件获取活性成分的质谱信息；

24、所述活性成分为绿原酸、木犀草苷、木犀草素-7-o-葡萄糖醛酸苷、3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、芹菜素-7-o-葡萄糖苷、4，5-二咖啡酰奎宁酸、芹菜素-7-o-β-d-(6”-o-乙酰基)葡萄糖苷和金合欢素-7-o-葡萄糖苷；

25、(5)活性成分的体外活性验证

26、将透明质酸酶抑制和自由基清除能力较强的三个化合物进行体外活性验证，通过软件作化合物浓度与抑制(清除)率的曲线，得到各活性化合物的ic50值，结果与高分辨生物活性谱中所示结果相一致；

27、所用软件为spssstatistics25.0；

28、所述的活性化合物为绿原酸、木犀草苷、3，5-二咖啡酰奎宁酸。

29、使活性成分的检测方法要求更具专属性，相较于传统检测本方法存在以下优点：

30、(1)全面系统表征化学成分。借助hplc及uplc实现高分离度和高分辨速度，结合qtof-ms/ms可实现高分辨分子量精确测定，适合复杂基质快速检测，可避免检测过程中假阳性和假阴性问题，且处理过程简单，有效扩大了技术可用性，降低实验操作要求。

31、(2)生物活性化合物定位直观。建立高分辨生物活性谱后，通过hplc对照色谱图可以直接定位具有透明质酸酶抑制活性(舒缓)和自由基清除活性(抗衰)化合物的对应峰，在单个分子水平上同时提供药理学和化学表征有关信息，优化传统活性测定前单体活性化合物提纯分离必要过程，有效降低检测成本。

32、(3)成分鉴定泛用性。结合杭白菊高分辨生物活性谱图结果和uplc-esi-qtof-ms/ms技术，不仅可以快速鉴定具有酶抑制活性和自由基清除活性的化合物，且利用uplc-esi-qtof-ms/ms技术可以同时鉴定杭白菊额外化合物分子及存在的同分异构体，发掘杭白菊潜在生物活性。

33、本方法首次建立基于高分辨生物活性谱-uplc-esi-qtof-ms/ms平台快速测定杭白菊中舒缓抗衰活性成分的方法并解析其裂解模式。能够准确快速分离并检测杭白菊舒缓抗衰成分及生物活性，操作简单、分辨率高且无需预纯化。

34、本发明的有益效果在于：

35、针对目前关于杭白菊提取物中生物活性成分筛选的相关方法较少，与发挥药效作用成分不明确的问题，本发明采用高分辨生物活性谱结合uplc-esi-qtof-ms/ms技术的方法，筛选出杭白菊中潜在舒缓抗衰活性成分信息，结合分子量和裂解模式对杭白菊内黄酮类和酚酸类成分进行分离与鉴定，并基于标准物质对照和体外验证实验进一步确定了杭白菊舒缓抗衰成分。本发明为杭白菊药效物质基础研究和成分鉴定提供了科学高效的方法。