一种基于溶胀和层层组装的“夹心型”交联聚苯乙烯分析磁珠及其制备方法和应用

本发明涉及一种基于溶胀和层层组装的“夹心型”交联聚苯乙烯分析磁珠及其制备方法和应用。

背景技术：

1、pct(降钙素原，procalcitonin)是一种蛋白质，当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时它在血浆中的水平升高。自身免疫、过敏和病毒感染时pct不会升高，因此它可以帮助鉴别细菌和病毒感染。pct在一些非感染类的疾病也可能会升高，比如手术之后、严重的创伤、烧伤、重症胰腺炎、持续性心源性休克等也会升高，这时就需要和细菌感染来鉴别。pct反映了全身炎症反应的活跃程度。影响pct水平的因素包括被感染器官的大小和类型、细菌的种类、炎症的程度和免疫反应的状况。

2、病原微生物仍是细菌感染诊断的金标准，但此方法检测时间长。临床怀疑是细菌感染性疾病的患者及时检测pct，有助于细菌感染性疾病的早期诊断，并且pct可指导临床抗生素的应用。

3、准确区分低浓度范围内的pct水平对指导合理抗生素治疗具有重要意义。《降钙素原pct急诊临床应用的专家共识》和《下呼吸道感染的国家抗生素指南和降钙素原抗生素处方指南》指出：当血清中pct水平低于0.1ng/ml时，强烈不推荐使用抗生素；血清中pct水平为0.1-0.25ng/ml时，不推荐使用抗生素；血清中pct水平为0.25-0.5ng/ml时，建议使用抗生素；血清中pct水平大于0.5ng/ml时，强烈建议使用抗生素。

4、有关pct的免疫检测分析方法有免疫荧光法、免疫化学发光法、酶联免疫吸附测定(elisa)。其中免疫荧光法作为一种定量的免疫化学检测方法，可以针对抗原以及抗体的高特异性，预先在聚酷膜上包被有金标记降钙素原(pct)的单克隆抗体和样本中的降钙素原结合。而后利用相关的仪器对检测区域进行扫描，进一步识别发光信号。通过将发光信号强度与pct进行比较，对pct标准浓度进行测定，同时制备曲线，进而得到标本的pct浓度值，该种方法通常较为简单而且具有一定的高精度特点，同时可重复进行操作，目前被广泛应用到实验室操作过程中，但是该种检测方法具有一定的局限性，主要体现在会出现假阴性或假阳性的结果。免疫化学发光法在进行检测过程中使用光标记抗体，另一抗体于试管内壁进行固定。该种诊断方法具有一定的特异性，同时又具备一定的高敏感性且操作简单，测量底线值较低，但发光试剂通常热稳定性较差，不便于长期保存。酶联免疫吸附测定是把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体结合。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅有无进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

5、免疫磁珠以其便于分离的特点在免疫分析领域中得到了广泛的应用。与常规检测模式相比相比，免疫磁珠的使用可实现目标物磁富集以提高信号灵敏度，可将捕获抗体偶联在磁珠上，简化了传统免疫测定需将抗体偶联在酶标板或试管中的步骤，同时在复杂溶液中也可实现抗原-抗体特异性结合和复合物的快速分离，减少了测试时间，简化了分离步骤。

6、目前免疫磁珠结构一般分为弥散型、核壳型、夹心型三种。弥散型磁珠中磁微粒分布在磁珠内部，其制备方法一般是在将聚合物微球造孔形成多孔微球再原位生长磁性物质，也有在聚合物合成的同时通过原位聚合将制备好的磁性物质包埋。核壳型免疫磁珠合成方法是先合成单颗粒磁性物质，再在外层包覆亲水性聚合物涂层。夹心型免疫磁珠内核为聚合物微球，中间层负载磁性粒子，最外层包覆亲水性聚合物。

7、国外著名磁珠品牌有美国赛默飞、日本jsr等。赛默飞旗下有关免疫磁珠子品牌有：thermo scientifictm、invitrogentm，其中invitrogen旗下dynabeads为其王牌免疫磁珠产品，my onetm系列磁珠更是被广泛用于科研及实际免疫分析检测，磁珠主要是以多孔微球作为模板，在孔道内原位生长磁性粒子，形成弥散型免疫磁珠，磁微粒均匀负载在微球内。但还存在着一些缺点，例如不能控制磁微粒负载量，且多孔微球制备过程复杂，原位生长难度较大，导致其成本及售价较高。

8、目前国内也有许多公司研发生产免疫磁珠，主要分为硅基磁珠和聚合物磁珠，但由于硅基磁珠批批间差异大、微球粒径不均一、单分散性差主要被用于核酸提取方向。国内较为领头的免疫磁珠公司有：博岳、苏州纳微、海狸等。博岳磁珠与thermo dynabeads有着相类似的弥散式结构，磁核材料为超顺磁性γ-fe2o3纳米颗粒，氧化铁含量在15％-20％。苏州纳微研发的磁性聚合物微球为夹层型结构，内部为多孔聚合物微球内核，外部包覆不同材质的聚合物包层以满足不同应用需求，磁性材料填充于二者之间的孔隙中，该系列微球直径介于1.0-5.0μm之间。但制备多孔聚合物微球需要进行造孔操作，增加了生产成本，且无法保证造孔均匀。海狸beaverbeadstm mag cooh系列磁珠是以fe3o4为磁核、聚合物为外壳，但这对合成单颗粒fe3o4的分散度要求较高，否则容易引起fe3o4磁核团聚而导致微球粒径不均一。

9、因此基于上述免疫磁珠技术的缺点，本发明介绍了一种溶胀和层层组装负载fe3o4，利用交联聚苯乙烯微球在良溶剂中溶胀和在不良溶剂中收缩的特性将fe3o4溶胀在微球中，赋予交联聚苯乙烯微球磁性，再通过pei与fe3o4的金属-配基亲和驱动组装，增加微球磁分性能。随后对组装体进行表面修饰使其可在水介质中稳定存在，并进一步将其用于酶联免疫吸附测定(elisa)检测pct。制备得到的交联聚苯乙烯分析磁珠尺寸均匀、磁分速度快、沉降时间慢、生物相容性好。为产业化分析磁珠提供一种有力的制备方法。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的上述技术问题，本发明的目的在于提供一种基于溶胀和层层组装的“夹心型”交联聚苯乙烯分析磁珠及其制备方法和应用。本发明以羧基化交联聚苯乙烯微球为模板，以溶胀法和层层自组装法负载fe3o4粒子，通过微球外包硅实现生物相容性，提供了一种尺寸均匀、磁分速度快、沉降时间慢、生物相容性好，检测性能好的分析磁珠。

2、本发明采用的技术方案如下：

3、所述的一种基于溶胀和层层组装的“夹心型”交联聚苯乙烯分析磁珠的制备方法，其特征在于以羧基化交联聚苯乙烯微球为模板，将微球模板在良溶剂中室温下溶胀过夜后，加入fe3o4纳米粒子超声，使fe3o4纳米粒子负载到溶胀的微球模板上形成微球组装体ps-mnps；然后不良溶剂收缩微球，之后在含有pei的不良溶剂中，利用pei与fe3o4的金属-配基亲和驱动组装油酸修饰的疏水fe3o4磁性纳米粒子，形成第二层fe3o4纳米粒子的负载，以增加微球的磁性；之后利用otms在微球组装体表面发生水解缩合反应，实现微球组装体从有机相到水相的相转移，接着通过teos在其表面水解生长二氧化硅壳层，制备得到表面有二氧化硅层的交联聚苯乙烯分析磁珠，最后依次经氨丙基三乙氧基硅烷进行氨基化修饰和琥珀酸酐进行羧基化修饰的操作，使微球表面进一步经氨基-羧基化修饰，得到羧基化的“夹心型”交联聚苯乙烯分析磁珠，即制备完成。

4、所述的一种基于溶胀和层层组装的“夹心型”交联聚苯乙烯分析磁珠的制备方法，其特征在于所述羧基化交联聚苯乙烯微球的制备方法为：将聚乙烯吡咯烷酮按照1g:60～80ml的固液比溶解在体积比8～10:1的乙醇-水混合液中，在氮气保护氛围下，升温至65-75℃后，加入苯乙烯、偶氮二异丁腈和丙烯酸，250-300rpm下搅拌反应3～5h后，逐滴加入溶有二乙烯基苯的无水乙醇，滴加完毕后，反应溶液继续搅拌，反应时长为20～30h；待反应结束后，离心分离出固体并用乙醇洗涤数次，最后将合成的聚苯乙烯微球干燥，即制备完成；其中，聚乙烯吡咯烷酮、苯乙烯、偶氮二异丁腈、丙烯酸和二乙烯基苯五者的投料比为(0.6～0.8)g：(6～7)ml：(0.07～0.1)g：(0.15～0.3)ml：(2～4)ml。

5、所述的一种基于溶胀和层层组装的“夹心型”交联聚苯乙烯分析磁珠的制备方法，其特征在于所述良溶剂为甲苯，所述微球模板与第一层fe3o4纳米粒子的质量比为10：6～10，优选为10：8；所述不良溶剂为乙醇。

6、所述的一种基于溶胀和层层组装的“夹心型”交联聚苯乙烯分析磁珠的制备方法，其特征在于负载第二层fe3o4纳米粒子的过程包括以下步骤：

7、1)将负载第一层fe3o4纳米粒子的微球组装体ps-mnps，分散在含有pei的乙醇溶液中，微球组装体ps-mnps与pei的质量比为1.2-1.5：1，旋转孵育1-3h后，磁分；

8、2)步骤1)所得微球分散在体积比1:2～4的甲苯-己醇混合液中，加入油酸修饰的疏水fe3o4磁性纳米粒子，旋转孵育1-3h后，磁分，即得到负载两层fe3o4纳米粒子的微球组装体；

9、步骤2)中微球与油酸修饰的疏水fe3o4磁性纳米粒子的质量比为1.5-2.5:1。

10、所述的一种基于溶胀和层层组装的“夹心型”交联聚苯乙烯分析磁珠的制备方法，其特征在于通过otms在微球组装体表面发生水解缩合反应，以及在表面水解生长二氧化硅壳层的具体过程为，包括以下步骤：

11、s1：向微球组装体中加入otms，超声混匀后加入甲醇和氨水，超声混合20-60min实现微球组装体从油相转移至水相，离心后除去上清液，用甲醇洗涤一次除去多余的otms；

12、s2：进一步在沉淀中加入超纯水和氨水，室温下搅拌反应15-20h，反应结束用乙醇洗涤数次，获得表面有机硅烷修饰的交联聚苯乙烯磁性微球；

13、s3：向步骤s2所得表面有机硅烷修饰的交联聚苯乙烯磁性微球中，加入超纯水和氨水，搅拌下加入teos，使得反应生长二氧化硅壳，反应结束后将产物离心、磁分离，并用乙醇洗涤数次，得到包覆二氧化硅壳层的交联聚苯乙烯磁性微球。

14、所述的一种基于溶胀和层层组装的“夹心型”交联聚苯乙烯分析磁珠的制备方法，其特征在于步骤s1中，otms的体积与微球组装体的质量之比为(8～20)μl:1mg，优选为(10～18)μl:1mg，otms、甲醇和氨水的体积之比是1:70～80:1.5～2；

15、步骤s1中otms的体积与步骤s2中氨水的体积之比2.5～3.5:1；

16、步骤s3中，teos与氨水的体积比为1:35～45，氨水质量浓度是25～30％；步骤s3中teos体积与步骤s1中微球组装体的质量之比为(10～18)μl:(10～18)mg。

17、本发明提供的一种基于溶胀和层层组装的“夹心型”交联聚苯乙烯分析磁珠在pct的均相分析分析中的应用，其特征在于应用方法包括以下步骤：

18、1)交联聚苯乙烯免疫磁性微球探针pmpms-mab1的制备：将羧基化的交联聚苯乙烯磁珠分散于磷酸盐pbs缓冲液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐edc和n-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐sulfo-nhs并搅拌反应20-40min，以活化缓冲液中的羧基化磁珠表面羧基；将活化的磁珠离心弃去上清并分散于pbs缓冲液中，然后加入降钙素原pct单克隆抗体，于室温下反应1～3h，再加入牛血清白蛋白bsa封闭1～3h；反应结束后，将产物用pbs缓冲液洗涤数次，通过磁分收集，得到的交联聚苯乙烯免疫磁性微球探针pmpms-mab1分散于pbs缓冲液中保存；

19、2)基于pmpms-mab1的酶联免疫吸附试验(elisa)检测：配制一系列不同浓度的pct标准溶液，取步骤1)得到的含有探针pmpms-mab1的pbs缓冲液加入至96孔板中，加入一系列不同浓度的pct标准样品溶液，孵育条件为37℃30min；孵育结束后冲液清洗数次；孔板中去除上清后，在孔板中剩余的微球中加入稀释好的mab2-hrp，孵育条件为37℃60min；孵育结束后冲液清洗数次；磁分清洗完成后，加入显色底物溶液，显色5-20min；最后，加入h2so4溶液终止反应；通过酶标仪读取检测吸光度结果，以吸光度为纵坐标、pct浓度为横坐标制作标准曲线进行定量分析；

20、3)按照步骤2)的操作步骤，将pct标准样品溶液替换为样品溶液进行检测，将最终的吸光度结果代入步骤2)绘制的标准曲线中，即可推断出样品溶液中pct含量。

21、本发明具有以下技术优点：

22、1、一种基于分散聚合法制备交联聚苯乙烯微球的方法，制备得到的微球单分散性好，球形度高，操作简单，易于合成，重复性及稳定性好。

23、2、一种基于溶胀法及层层组装法制备的交联聚苯乙烯磁性微球。利用交联聚苯乙烯微球在良溶剂中溶胀，在不良溶剂中收缩的特性，将纳米fe3o4颗粒负载在交联聚苯乙烯微球内部，简化了负载步骤，可实现油相组装。通过pei与fe3o4的金属-配基亲和驱动组装，将纳米fe3o4颗粒负载在微球表面，操作简单，同时解决了因溶胀法可能导致微球上纳米fe3o4颗粒负载量不高的问题。本发明微球上纳米fe3o4负载量高可实现磁珠的快速分离，微球上纳米fe3o4分布均匀可为磁珠均相免疫反应提供较好的悬浮性。而现有技术中负载一层纳米fe3o4或者fe3o4负载量少的微球相较于本发明，磁分时间长，不利于分析过程中的磁分步骤。

24、3、一种在二氧化硅包覆的交联聚苯乙烯磁性微球表面巯基改性的方法。通过乙醇/氨水/水解体系，3-巯基丙基三甲氧基硅烷在表面水解并接枝在二氧化硅表面。

25、4、一种免疫磁珠与elisa结合的检测方法，相比于传统elisa的非均相反应过程，减少了在酶标板上抗原或抗体的固定和清洗步骤。同时免疫磁珠可以为分析检测实验提供磁富集、磁分清洗，简化了实验步骤，提高分析灵敏度。

26、与现有技术相比，本发明取得的技术效果是：

27、1、以交联聚苯乙烯为骨架的单分散功能微球，具有优良的不可生物降解性、热稳定性及化学稳定性粒径均一，质量轻。

28、2、使用具有可溶胀收缩的交联聚苯乙烯微球作为载体，微球在易溶溶剂中溶胀但不溶解，在不溶溶剂中可收缩的特性，可提供简单的将磁性物质包覆在微球内的方法，无需对油溶性纳米fe3o4粒子进行改性，简化了实验过程中的操作，与常规负载方法相比能更简便的实现磁性物质的负载。再通过pei的层层组装将第二层纳米fe3o4颗粒负载在微球表面，操作简单，同时解决了因溶胀法导致微球上纳米fe3o4颗粒负载量不高的问题。制备得到的交联聚苯乙烯磁性微球可以在外加磁场条件下实现快速分离。

29、3、与多数用高分子包裹法封装聚合物微球不同的是，本实验以胶体化学的手段对微球进行包硅，可使微球表面更易于改变修饰不同的基团，可用根据不同的实际应用需求来改变微球外部基团，以实现材料的多重生物化应用。