一种基于上转换发光的微流体生物传感平台

本发明涉及食品安全检测，特别涉及一种基于上转换发光的微流体生物传感平台。

背景技术：

1、内分泌干扰化学物(edcs)被定义为“干扰存在于人体内部负责平衡、繁殖和发育过程的天然血源性激素的合成、分泌、运输、代谢、结合或消除的外源性制剂”。人类可能通过食品生产(食品添加剂、杀虫剂、食品容器)、工业活动(空气污染、水污染物、工业化学品)、医疗(医疗产品)等摄入数百种edcs。其中，具有雌激素作用的外源性制剂，例如双酚a(bpa)、己烯雌酚(des)、雌二醇(e2)、壬基酚等吸引了广泛的关注，这类edcs可能会导致严重的健康危害，包括神经发育障碍，脑、肝和肺损伤，生殖和内分泌失调，代谢紊乱等。因此，建立有效的评估方法来确定人类可能接触媒介中的edcs含量是非常重要的。

2、以往的研究中，对于edcs含量的测定是基于高效液相色谱、气质联用色谱、电化学传感器、光电化学免疫传感器等方法，但这些测定方法往往面临着检测仪器设备昂贵、背景干扰强、样品预处理步骤繁琐、试剂消耗量大等困难，难以实现edcs的现场快速定量检测。因此，开发新型的检测平台用以克服上述缺陷是至关重要的。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于上转换发光的微流体生物传感平台，用以实现对edcs的微量取样和简便的高灵敏定量检测。

2、基于此，本发明的目的在于提供一种基于上转换发光的微流体生物传感平台，包括：上转换发光的生物传感器，用于特异性识别edcs；以及微流体芯片，作为所述上转换发光的生物传感器与待测样本反应平台，用于集成所述上转换发光的生物传感器与待测样本的混合、反应、分离、检测；

3、所述微流体芯片，包括：进样池，用于所述上转换发光的生物传感器和待测样本进样；弧形通道，所述弧形通道的进料口同时连通于所述上转换发光的生物传感器的进样池和待测样本的进样池，待所述上转换发光的生物传感器和待测样本进入弧形通道后，弧形通道用于二者的混合和反应；分离通道，与所述弧形通道的出料口连通，用于反应结束后的所述上转换发光的生物传感器的磁分离；检测池，与所述分离通道的出料口连通，用于发光增强定量检测edcs。

4、进一步地，所述微流体芯片的所有微通道的宽度均为400μm，深度均为200μm。

5、根据上述技术方案，上转换发光的生物传感器与待测样本在微流体芯片上的混合、反应、分离、检测集成，其具体过程为：将上转换发光的生物传感器与待测样本分别从微流体芯片的两个进样池注入，两种微流体在弧形通道内充分混合、反应；之后在分离通道处外加磁场，分离未与edcs反应的生物传感器；最后在检测池中，脱落的csucnps完成桥连絮凝和沉降，并完成上转换荧光信号的采集，从而可以定量检测edcs。

6、进一步地，生物传感器与待测样本溶液的注射流速为12μl/min和3μl/min。

7、进一步地，生物传感器与待测样本溶液的注射时间为8-12min。

8、本发明的第二目的在于提供上述一种基于上转换发光的微流体生物传感平台的制备方法。

9、所述上转换发光的生物传感器的制备方法包括如下步骤：

10、s1、制备含有稀土元素的上转换纳米粒子种子(cucnps)；

11、s2、步骤s1制备得到的cucnps外层进行包覆处理，制备得到具有核壳结构的上转换纳米粒子(csucnps)；

12、s3、改性步骤s2制备得到的csucnps为亲水性；

13、s4、将步骤s3得到的亲水性csucnps生物分子功能化，得到生物分子功能化csucnps；

14、s5、制备磁性纳米粒子(mnps)；

15、s6、将步骤s5得到的mnps生物分子功能化，得到生物分子功能化mnps；

16、s7、步骤s4得到生物分子功能化csucnps和步骤s6得到生物分子功能化csucnps相结合，制备得到所述上转换发光的生物传感器。

17、进一步地，步骤s1的过程为，

18、分别取六水合氯化钇、六水合氯化镱和六水合稀土元素溶解于甲醇中，之后加入油酸和1-十八稀，混合后加热至150-170℃反应25-35min，反应结束冷却后，滴加氢氧化钠和氟化铵的混合溶液，并于125-135℃反应25-35min，随后升温至290-310℃保持50-60min；反应结束后，加入乙醇和超纯水离心分离得到上转换纳米粒子种子(cucnps)。

19、进一步地，所述六水合氯化钇、六水合氯化镱和六水合稀土元素的总用量为1-1.5mmol。

20、进一步地，所述稀土元素为铒时，六水合氯化钇、六水合氯化镱和六水合稀土元素的比例为0.78:0.2:0.02。

21、进一步地，所述稀土元素为铥时，六水合氯化钇、六水合氯化镱和六水合稀土元素的比例为0.795:0.2:0.005。

22、进一步地，所述甲醇、油酸、1-十八稀的体积比例为10:(5-7):(14-17)。

23、进一步地，所述氢氧化钠和氟化铵的摩尔比为5:(7-9)。

24、进一步地，所述乙醇和超纯水的体积比为1:(0.6-1)。

25、进一步的，所述离心参数为8000-12000rpm转速下离心5-10min。

26、进一步地，步骤s2的过程为，

27、取六水合氯化钇溶解于甲醇中，之后加入油酸和1-十八稀，混合后加热至150-170℃反应25-35min；反应结束冷却后，加入步骤s1制备得到的cucnps，并滴加氢氧化钠和氟化铵的混合溶液，并于125-135℃反应25-35min，随后升温至290-310℃保持20-40min；反应结束后，加入乙醇和超纯水离心分离得到核壳上转换纳米粒子(csucnps)。

28、进一步地，所述六水合氯化钇的用量为0.35-0.45mmol。

29、进一步地，所述甲醇、油酸、1-十八稀的体积比例为10:(2.5-3.5):(7-9)。

30、进一步地，所述氢氧化钠和氟化铵的摩尔比为2:(2.5-3.5)。

31、进一步地，所述乙醇和超纯水的体积比为1:(0.6-1)。

32、进一步的，所述离心参数为8000-12000rpm转速下离心5-10min。

33、进一步地，步骤s3的过程为，

34、取步骤s2制备得到的csucnps加入三氯甲烷和甲苯的混合溶液中，随后加入聚丙烯酸水溶液并密封，剧烈搅拌反应；结束后使用乙醇和超纯水清洗并离心，得到具有亲水性的聚丙烯酸修饰的csucnps(paa-csucnps)。

35、进一步地，所述csucnps、三氯甲烷、甲苯和聚丙烯酸的比例为50mg:(2-6ml):(4-10ml):(15-20ml)。

36、进一步地，所述聚丙烯酸水溶液浓度为10-20mg/ml。

37、进一步地，所述搅拌反应时间为24-48h。

38、进一步地，所述乙醇和超纯水的体积比为1:(0.6-1)。

39、进一步的，所述离心参数为8000-12000rpm转速下离心5-10min。

40、进一步地，步骤s4的过程为，

41、取步骤s3制备得到的paa-csucnps，加入含有碳酰二亚胺和n-羟基硫代琥珀酰亚胺的吗啉乙磺酸缓冲溶液中，进行第一次孵育；孵育结束后，离心分离得到活化的paa-csucnps，并分散在磷酸盐缓冲液中；向溶液中加入链霉亲和素溶液，进行第二次孵育；孵育结束后，离心分离得到修饰链霉亲和素的csucnps，并分散在磷酸盐缓冲液中；随后加入5’端修饰生物素的edcs适配体，进行第三次孵育；孵育结束后离心分离得到修饰适配体的csucnps，并重新分散在磷酸盐缓冲液中；随后加入牛血清白蛋白溶液，进行第四次孵育；孵育结束后离心分离，并使用磷酸盐缓冲液清洗，制备得到生物分子功能化的csucnps。

42、进一步地，所述paa-csucnps、碳酰二亚胺、n-羟基硫代琥珀酰亚胺和吗啉乙磺酸缓冲溶液的比例为(0.8-1.2mg):4mg:2mg:(2.0-2.4ml)。

43、进一步地，第一次孵育条件为20-40℃，2-4h。

44、进一步地，链霉亲和素的用量为0.8-1.2mg。

45、进一步地，第二次孵育条件为30-40℃，10-14h。

46、进一步地，适配体的用量为200-300μl，浓度为10μm。

47、进一步地，第三次孵育条件为30-40℃，10-14h。

48、进一步地，牛血清白蛋白的用量为3-6ml，质量分数为2％。

49、进一步地，第四次孵育条件为30-40℃，1.5-3h。

50、进一步地，步骤s4中，离心分离参数为8000-12000rpm转速下离心5-10min。

51、进一步地，步骤s4中，磷酸盐缓冲液的ph为7.2-7.4，用量为5-15ml。

52、进一步地，步骤s5的过程为，

53、分别取六水合氯化铁、二水合柠檬酸三钠、醋酸钠加入乙二醇溶液中，剧烈搅拌充分溶解后，转移到反应釜中，高温反应；反应结束通过磁场收集制备得到的磁性纳米粒子(mnps)，并使用乙醇和超纯水清洗。

54、进一步地，六水合氯化铁、二水合柠檬酸三钠、醋酸钠和乙二醇用量比例为5mmol:0.4mmol:(1.2-1.5g):(15-25ml)。

55、进一步地，高温反应的条件为190-210℃，8-12h。

56、进一步地，所述乙醇和超纯水的体积比为1:(0.6-1)。

57、进一步地，步骤s6的过程为，

58、取步骤s5制备得到的mnps，加入含有碳酰二亚胺和n-羟基硫代琥珀酰亚胺的吗啉乙磺酸缓冲溶液中，进行第一次孵育；孵育结束后，磁分离得到活化的mnps，并分散在磷酸盐缓冲液中；向溶液中加入链霉亲和素溶液，进行第二次孵育；孵育结束后，磁分离得到修饰链霉亲和素的mnps，并分散在磷酸盐缓冲液中；随后加入5’端修饰生物素的edcs适配体互补序列，进行第三次孵育；孵育结束后磁分离得到修饰适配体的mnps，并重新分散在磷酸盐缓冲液中；随后加入牛血清白蛋白溶液，进行第四次孵育；孵育结束后磁分离，并使用磷酸盐缓冲液清洗，制备得到生物分子功能化的mnps。

59、进一步地，所述mnps、碳酰二亚胺、n-羟基硫代琥珀酰亚胺和吗啉乙磺酸缓冲溶液的比例为(8-12mg):10mg:5mg:(0.8-1.2ml)。

60、进一步地，第一次孵育条件为20-40℃，2-4h。

61、进一步地，链霉亲和素的用量为0.8-1.2mg。

62、进一步地，第二次孵育条件为30-40℃，10-14h。

63、进一步地，适配体互补序列的用量为200-300μl，浓度为10μm。

64、进一步地，第三次孵育条件为30-40℃，10-14h。

65、进一步地，牛血清白蛋白的用量为3-6ml，质量分数为2％。

66、进一步地，第四次孵育条件为30-40℃，1.5-3h。

67、进一步地，步骤s4中，磷酸盐缓冲液ph为7.2-7.4，用量为5-15ml。

68、进一步地，步骤s7的过程为，

69、取步骤s4制备得到的生物分子功能化的csucnps和步骤s6制备得到的生物分子功能化的mnps加入磷酸盐缓冲液中，高温加热；加热结束后缓慢退火，并转移至摇床孵育；孵育结束后，磁分离得到上转换发光的生物传感器，并使用磷酸盐缓冲液清洗三次，最后分散于磷酸盐缓冲液中。

70、进一步地，edcs适配体修饰的csucnps和edcs适配体互补序列修饰的mnps质量比为(1.5-2):5。

71、进一步地，高温反应条件为90-95℃，3-5min。

72、进一步地，退火条件为3-5℃/min，至60-65℃。

73、进一步地，孵育条件为20-40℃，0.5-2h。

74、进一步地，步骤7中，磷酸盐缓冲液ph为7.2-7.4，用量为5-10ml。

75、根据上述技术方案，适配体介导的纳米粒子桥连絮凝，用以实现所述上转换发光的生物传感器的高效发光增强过程为，将步骤s7制备的上转换发光的生物传感器与待测样本溶液混合反应后，适配体与edcs特异性的结合，导致csucnps从mnps表面脱落；磁分离去除未与edcs靶标反应的生物传感器，脱落在溶液中的csucnps反映了靶标edcs的数量；脱落的csucnps表面未结合靶标edcs的适配体发生碱基的互补配对，产生适配体介导的纳米粒子桥连絮凝，进一步沉降，实现纳米粒子的浓度富集；通过优化调节焦距，对沉降的csucnps信号采集，实现发光增强定量检测edcs。

76、进一步地，步骤s7制备的上转换发光的生物传感器与待测样本溶液体积比4:1。

77、进一步地，信号采集的焦距为11.5mm。

78、进一步地，脱落的csucnps的沉降时间为20-30min。

79、本发明的第三目的在于提供上述的一种基于上转换发光的微流体生物传感平台的使用方法，具体包括以下步骤：

80、取0-250ng/ml一系列浓度的edcs标准溶液，与制备的上转换发光生物传感器共同注射进入所述微流体芯片中，完成生物传感器与靶标edcs的混合、反应、分离与检测步骤；

81、静置以完成脱落的csucnps的桥连絮凝和沉降，通过荧光光谱仪采集检测池中沉降形成的csucnps界面的荧光光谱，以edcs标准溶液的浓度对数值和荧光信号特征值进行线性拟合，建立edcs含量检测的标准曲线；所述荧光信号特征值为特异性识别edcs的生物传感器使用的稀土元素的特征荧光发射光强；

82、取待测样本溶液，代替上述edcs标准溶液，与生物传感器共同注射进入微流体芯片，将采集得到的荧光信号特征值代入标准曲线计算，得出待测样本中edcs的含量。

83、综上所述，本发明具有以下有益效果：

84、1、本发明公开了一种新型的适配体介导的纳米粒子桥连絮凝现象，并基于此发现，实现了纳米生物传感器荧光信号的大幅度增强，这极大的提高了对靶标检测的灵敏度，将检测限提升至少一个数量级；此外，通过适配体介导纳米粒子桥连絮凝形成稳定界面，大大减少了重力场对纳米粒子分散液的影响，有效提高纳米生物传感器的信号稳定性。

85、2、本发明设计了一种新型的微流体芯片，在有限的空间内集成了126个半圆通道和12个四分之一圆弧通道，为雷诺数约为0.79的层流态微流体增加湍流程度，实现了生物传感器与待测样本的重复混合与反应，通过外加磁场的辅助，实现了再微流体芯片上的混合、反应、分离、检测步骤的一体化集成，大大提高了检测效率。

86、3、本发明制备了一种上转换发光的微流体生物传感器，上转换发光过程有效的避免了其它基质的背景荧光干扰，同时生物识别元件适配体具有良好的经济性和特异性；进一步在芯片上集成为微流体生物传感器后，实现了微量取样(30μl)和快速检测(10min)，这为实际现场应用提供了良好的前景。

87、4、本发明实现了多种edcs的同时检测。低于危害阈值的单一edcs成分，在多种edcs混合后，可能呈现严重的健康危害，即可能存在累计效应。本发明通过调谐制备多色csucnps并分别修饰特异性edcs适配体，制备了同时检测bpa和des的生物传感器，并实现了低至0.0076ng/ml和0.0131ng/ml的超灵敏检测。