来那度胺在尿液中的代谢物及应用的制作方法

本发明属生物医药，具体涉及人尿液中来那度胺代谢物的分析方法、质谱鉴定及作为诊断标志物在制备鉴别多发性骨髓瘤患者来那度胺耐药的产品中的应用。

背景技术：

1、来那度胺，被批准用于治疗各种癌症包括多发性骨髓瘤(mm)、套细胞淋巴瘤(mcl)、滤泡性淋巴瘤(fl)、边缘区淋巴瘤(mzl)等。多发性骨髓瘤(mm)是血液系统的第二大常见恶性肿瘤，约占血液系统恶性肿瘤的10％。我国mm发病率为1.6/10万且呈逐年增高状态，发病年龄有年轻化趋势。

2、来那度胺主要在肾脏消除，约90％通过尿液消除，尿中代谢物是药物与机体作用的最终结果反映，可以直接准确地反映药物在体内的代谢情况、机体的病理和生理情况，更重要的是尿液获取方便、简单、无创、快速、易行，尿液代谢物已成为一种理想的评估药物在体内的代谢情况及临床筛查和早期诊断手段。

3、成都中医药大学罗莉娅等开发了uplc－ms/ms法研究来那度胺在小鼠体内的组织分布[1]。muzaffar iqbal等开发了串联质谱法测定兔和人血浆中来那度胺[2]，但都是利用动物或人的血浆和组织检测，检测的是来那度胺，没有对人尿中来那度胺代谢物进行检测和鉴定。

4、来那度胺治疗的患者中，少数患者病情恶化，而其他患者病情保持稳定或好转。因此，如果能在症状恶化前及时筛选出耐药患者，及时对此类患者采取其他治疗方案，就能避免症状恶化及昂贵且不必要的治疗。

5、ngyld等报道了，收集5例患者治疗前和复发时的骨髓样本，进行基于串联质谱标记技术(tmt)的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析和rna测序，确定了cdk6是在治疗难治复发多发性骨髓瘤中的主要调控因子[3]，但由于采用的是骨髓样本，取样有创、不易行。同济大学附属第十人民医院血液科报道了：crbn的基因突变能导致来那度胺耐药[4]，但鉴定需要进行基因检测，检测昂贵且复杂。

6、特拉维夫大学萨克勒医学院的yael c.cohen等报道采用患者血液或骨髓进行单细胞测序鉴定复发性多发性骨髓瘤患者耐药途径及治疗靶点[5]，但采用患者血液或骨髓，取样有创，操作复杂，而且目前仅限于少数实验室能做单细胞基因组分析。

7、现有技术文献

8、[1]罗莉娅,邓星,苟立平,等.uplc-ms/ms法研究来那度胺在小鼠体内的组织分布[j].中国临床药理学杂志,2019,35(14):5.

9、[2]iqbal m,wani t a,nasr y khalil…developmentand validation ofultra-performance liquid chromatographic method with tandem mass spectrometryfor determination of lenalidomide in rabbit and human plasma[j].chemistrycentral journal,2013,7(1):7.

10、[3]李新,郭彩虹,黄仲夏.来那度胺在多发性骨髓瘤治疗中的应用[j].临床药物治疗杂志,2013.

11、[4]胡柯,陶怡,施菊妹.多发性骨髓瘤的精准医疗:耐药机制与相关生物学标志物的探索[j].上海医学,2021,44(6):5.

12、[5]zada,m.,wang,s.y.,bornstein,c.,david,e.,moshe,a.,li,b.,...&amit,i.identification of resistance pathways and therapeutic targets in relapsedmultiple myeloma patients through single-cell sequencing.nature medicine.

技术实现思路

1、发明所要解决的问题：

2、本发明建立一种人尿中11种来那度胺代谢物的快速灵敏的分析方法；对代谢物进行了质谱鉴定；比较了缓解期(eg)、症状无变化(sg)，症状恶化(ig)多发性骨髓瘤患者之间代谢物的差异，从代谢物分析的角度，研究利用尿中代谢物鉴别来那度胺耐药。

3、本发明解决了尚无快速灵敏的尿中来那度胺代谢物的分析方法和尚没有对尿中来那度胺代谢物进行质谱鉴定问题，从而为分析来那度胺在体内的代谢情况、机体的病理和生理情况提供了可能性；解决了尚无尿中代谢物作为耐药标志物的问题，从而为早期快速筛选出来那度胺耐药患者提供了可能性，避免患者症状恶化及不必要的治疗。

4、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

5、本发明第一方面是提供一种人尿液中来那度胺代谢物的分析方法，包括如下步骤：

6、(1)样本

7、以未经来那度胺治疗的膀胱癌患者尿液样本作为空白样本(bs)，以来那度胺治疗的膀胱癌患者尿液样本作为分析样本。分析样本被分为三组：来自缓解期患者(eg)、症状无变化的患者(sg)，以及其他来自症状恶化的患者(ig)。

8、(2)供试品溶液和对照品溶液的配制

9、供试品溶液：每500～1000μl的尿液样本在冷冻干燥机中干燥，然后溶解在甲醇、乙腈和水的混合物(1：3：5)中1～5ml中。溶液在-20～-40℃下保存，并在分析前通过0.22μm过滤膜过滤。

10、对照品溶液：来那度胺精确称量，并溶解在甲醇中并稀释成每1ml中含0.1～10μg的溶液。

11、(3)将供试品溶液和对照品溶液进行uplc-ms/ms分析

12、uplc条件：柱温为40℃；流动相a为0.1％甲酸水，流动相b为0.1％甲酸乙腈；进样量为2μl；流速为0.1～0.5ml/min；梯度洗脱，所述梯度洗脱条件如下：

13、0min 5％ b；5min 95％ b

14、质谱条件：大气压化学电离或电喷雾电离；质量分析器为线性或三维离子肼质谱、四级杆飞行时间质谱、静电场轨道离子肼质谱或三重四级杆质谱；正离子扫描模式采集一级质谱图和二级质谱图，采集范围m/z50-2000，二级质谱碰撞能量为10-70v。

15、进一步地，分析方法包括如下步骤：

16、供试品溶液：每600μl的尿液样本在冷冻干燥机中干燥，然后溶解在甲醇、乙腈和水的混合物(1:3:5)中2ml中。溶液在-20℃下下保存，并在分析前通过0.22μm过滤膜过滤。

17、对照品溶液：来那度胺精确称量，并溶解在甲醇中并稀释成每1ml中含0.5μg的溶液。

18、uplc条件：柱温为40℃；流动相a为0.1％甲酸水，流动相b为0.1％甲酸乙腈；进样量为2μl；流速为0.35ml/min；梯度洗脱，所述梯度洗脱条件如下：

19、0min 5％ b；5min 95％ b

20、质谱条件：电喷雾电离；质量分析器为四级杆飞行时间质谱；正离子扫描模式采集一级质谱图和二级质谱图，采集范围m/z100-1500，二级质谱碰撞能量为20-60v。

21、进一步地，尿液冻干的温度为-50～-80℃。

22、进一步地，尿液冻干的温度为-60～-70℃。

23、本发明第二方面是对尿中11种来那度胺代谢物进行了分析。

24、我们使用adme预测因子来预测来那度胺的i级和ii级代谢物。利用peakview 1.2软件对基于ms和ms/ms碎片离子的质量数据进行了处理。基于大量数据，分析每个样本中来那度胺的代谢物。在一个合理的误差范围内(测量分子量与理论分子量之间的误差在10ppm以内被认为是合理的)，分析各代谢物的结构，并比较样品之间的差异。

25、adme预测显示有14种代谢物，包括来那度胺的i级和ii级代谢物，代谢试验共检测到192种二项式代谢物，其中eg中检测到79种代谢物，sg中有95个代谢物，ig中有94个代谢物，结合预测结果和代谢组学检测结果，最后用uplc-q-tof-ms对11个来那度胺的代谢物进行了表征。

26、来那度胺和bs、eg、sg、ig的基峰色谱图(bpc)如图1所示，来那度胺的保留时间为2.947min，bs、eg、sg、ig的bpc值均无显著性差异，因此，我们对代谢物进行了分析，以供进一步研究。

27、adme预测显示来那度胺有14个i级和ii级代谢物。其中c1-c7是cyp3a4催化的来那度胺的i级代谢产物。c11是来那度胺的ii级代谢物，由ugt1a6，ugt1a9和ugt2b7代谢，c8、c9、c10、c12、c13、c14是cyp3a4催化的c5的代谢产物(如图2所示)，如图2a所示，来那度胺的i级代谢物均为由cyp3a4代谢的羟基化来那度胺，其范围狭窄，不能全面预测cyp450s代谢的其他代谢物。如图2b所示，c8、c9、c13和c14，羟基化的c5s，是cyp3a4催化的c5的i级代谢产物，c10是脱氢化的c8，此外，它还包括其他类型的代谢物，如c12。这些结果初步表明，来那度胺的主要代谢物仍可进一步代谢。

28、根据bpc的数据，来那度胺的保留时间为2.947min。对来那度胺进行了二次质谱分析，其特征离子的质荷比(m/z)为260.1040的[m+h]+，质荷比(m/z)为215.1079的[m+h-co-nh3]+，质荷比(m/z)为187.0868的[m+h-2co-nh3]+，质荷比(m/z)为149.0712的[m+h-2co-nh3-c3h2]+和质荷比(m/z)为106.0651的[m+h-2co-nh3-c3h2-conh]+，其理论分子量与实际测量值之间的差异是合理的，来那度胺的结构式见图3。11种代谢物的质谱/质谱图如图4所示，分析11种代谢物的结构如下：

29、来那度胺代谢物m1,通过[m+h]+离子的质荷比(m/z)为245.0926推导其分子式为c13h12n2o3，其特征离子为质荷比(m/z)245.0926的[m+h]+，质荷比(m/z)为172.0746的[m+h-c2nh2o2]+，结构为c4-脱氨来那度胺，命名为邻苯二甲酰亚胺氨基戊二酰亚胺/异构体，是一种聚酮化合物，结构式如m1所示：

30、

31、来那度胺代谢物m2，通过[m+h]+离子的质荷比(m/z)为245.0926推导其分子式为c13h12n2o3，m2的碎片离子为质荷比(m/z)245.0926的[m+h]+，质荷比(m/z)为170.0605的[m+h-c2no2h5]+，质荷比(m/z)为142.0652的[m+h-c3no3h5]+，结构为c1′-脱氨来那度胺，被导入到sci-finder网站，发现是一种潜在的新型化合物，命名为去硝基化-2邻苯二甲酰亚胺氨基戊二酰亚胺，属于聚酮类，结构式如m2所示：

32、

33、来那度胺代谢物m3,通过[m+h]+离子的质荷比(m/z)为149.0702推导其分子式为c8h8n2o，m3的特征离子为质荷比(m/z)149.0698的[m+h]+，质荷比(m/z)为106.0649的[m+h-cnoh]+，结构为c2-c3'氢化，去戊二酰亚胺来那度胺，命名为4-氨基异吲哚林-1-酮，结构式如m3所示：

34、

35、来那度胺代谢物m4，通过[m+h]+离子的质荷比(m/z)为134.0595推导其分子式为c8h7no，m4的产生的主要ms离子为质荷比(m/z)134.0585的[m+h]+，质荷比(m/z)为116.0503的[m+h-h2o]+，质荷比(m/z)为106.0665的[m+h-co]+，质荷比(m/z)为79.0550的[m+h-co-cnh2]+，结构为c4-脱氨m3，命名为1-二氢异戊二醇/异构体，结构式如m4所示：

36、

37、来那度胺代谢物m5，通过[m+h]+离子的质荷比(m/z)为134.0594推导其分子式为c8h7no，m5的特征离子为质荷比(m/z)134.0585的[m+h]+，质荷比(m/z)为116.0503的[m+h-h2o]+，质荷比(m/z)为106.0665的[m+h-co]+，质荷比(m/z)为79.0550的[m+h-co-cnh2]+，为c2-脱氨的m3，为m4的异构体，与m4一样是一种生物碱化合物，结构式如m5所示：

38、

39、            

40、来那度胺代谢物m6，通过[m+h]+离子的质荷比(m/z)为114.0563推导其分子式为c5h7no2，m6的特征离子为质荷比(m/z)114.0563的[m+h]+，质荷比(m/z)72.9390的[m+h-cno]+，结构为c2-c3'氢化，戊二酰亚胺保留的来那度胺，命名为戊二酰亚胺/异构体，结构式如m6所示：

41、

42、来那度胺代谢物m7，通过[m+h]+离子的质荷比(m/z)为161.0956推导其分子式为c10h12n2，m7的特征离子为质荷比(m/z)161.0956的[m+h]+，质荷比(m/z)146.0692的[m+h-nh]+，将m7的结构c2-c8 de-co和c3'-c5'de-c2ho2n来那度胺导入sci-finder网站，发现它是一种潜在的新型化合物，命名为环丙烷-脱氧4-氨基异吲哚林-1-one-1。属于氨基修饰碳氢化合物，结构式如m7所示：

43、

44、来那度胺代谢物m8，通过[m+h]+离子的质荷比(m/z)为149.0916推导其分子式为c10h11n，m8的特征离子为质荷比(m/z)146.0916的[m+h]+，质荷比(m/z)104.0703的[m+h-c3h6]+,将m8的结构c2-c8 de-co，c4-脱氧和c3'-c5'de-c2ho2n来那度胺导入sci-finder网站，发现它是一种潜在的新型化合物，命名为环丙酸-c4脱氧-氨基异吲哚林-1-one-2，结构式如m8所示：

45、

46、来那度胺代谢物m9，通过[m+h]+离子的质荷比(m/z)为278.1131推导其分子式为c13h5n3o4，m9的碎片离子为质荷比(m/z)278.1131的[m+h]+，质荷比(m/z)261.0855的[m+h-nh3]+，质荷比(m/z)233.0933的[m+h-nh3-co]+，质荷比(m/z)187.0856的[m+h-nh3-co-co2h2]+，结构为n1'氢化，c6'羟基化来那度胺，命名为4-氨基-γ-(氨基羰基)-1,3-2氢-1-氧-2h-异吲哚-2-丁酸。属于生物碱类，结构式如m9所示：

47、

48、来那度胺代谢物m10，通过[m+h]+离子的质荷比(m/z)为297.1076推导其分子式为c13h6n2o6，m10的碎片离子为质荷比(m/z)297.1076的[m+h]+，质荷比(m/z)281.0522的[m+h-nh2]+,将m10的结构n1'去氨基，c2'羟基化，c6'羟基化，n2氢化，c1羟基化来那度胺导入sci-finder网站，发现它是一种潜在的新型化合物，命名为去氮-羟基4-氨基-γ-(氨基羰基)-1,3-2氢--1-氧-2h-异吲哚-2-丁酸，结构式如m10所示：

49、

50、来那度胺代谢物m11，通过[m+h]+离子的质荷比(m/z)为276.0972推导其分子式为c13h13n3o4，m11的碎片离子为质荷比(m/z)276.0972的[m+h]+，质荷比(m/z)203.0790的[m+h-c2h3no2]+，质荷比(m/z)165.0660的[m+h-c5h5no2]+，质荷比(m/z)148.0381的[m+h-c5h5no2-nh3]+，质荷比(m/z)122.0578的[m+h-c5h5no2-conh]+，结构为5-羟基-来那度胺，属于生物碱类，结构式如m11所示：

51、

52、上述人尿中来那度胺11种代谢物的结构、分子式、分子量见图5；11种代谢物见表1。

53、

54、

55、本发明第三方面是对11种代谢物与来那度胺耐药的关联性进行分析代谢物m1-m11分别在表2中的样品出现。

56、表2

57、 代谢物 存在的样品 m1 所有样品(eg、sg、ig) m2 sg、ig m3 几乎所有样品(eg、sg、ig) m4 所有样品(eg、sg、ig) m5 所有样品(eg、sg、ig) m6 所有样品(eg、sg、ig) m7 所有样品(eg、sg、ig) m8 所有样品(eg、sg、ig) m9 所有样品(eg、sg、ig) m10 所有样品(eg、sg、ig) m11 eg、ig

58、对11种代谢物的统计分析表明，m2和m11是区分每个样品的重要化合物，m2仅在sg和ig中检测到，m11仅在eg和ig中检测到，我们又选择了4个样品，在临床效果未知的情况下对样品进行了液质分析。最终结果显示，在4个样品中均能检测到m2，而m11没有分布规律。根据以上检测结果，我们推断17-20例患者应分为ig或sg。经过几天的观察，4例患者的临床指标较为稳定，说明m2可作为鉴别多发性骨髓瘤患者来那度胺治疗耐药的诊断标志物。

59、基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

60、本发明建立了一种快速、灵敏的uplc-ms/ms来那度胺代谢物定性分析方法，共鉴定了11种代谢物，其中包括4种潜在的新化合物，从而为分析来那度胺在体内的代谢情况、机体的病理和生理情况提供了可能性，另外发现代谢物m2可作为鉴别多发性骨髓瘤患者来那度胺治疗耐药的诊断标志物。