生物样品中黄腐酚及其体内外代谢产物的检测方法

本发明涉及生物样品中黄腐酚及其体内外代谢产物的检测方法。

背景技术：

1、啤酒花是一种药食同源的植物，主要用于啤酒的制造过程，是啤酒生产的基本原料，其雌花不仅能够赋予啤酒香味和苦味，还能增加啤酒的防腐能力和非生物稳定性，是酿造啤酒的主要原料之一。

2、黄腐酚是雌性啤酒花中特有的异戊二烯基黄酮类物质，是由啤酒花的蛇麻腺分泌产生，目前被发现仅存在于啤酒花中，占啤酒花干重的0.1～1.0％。黄腐酚特殊的结构赋予其多重药理活性，大量研究表明黄腐酚在预防癌症、抗菌抗病毒、抗氧化、预防糖尿病、动脉粥样硬化以及抗骨质疏松等方面发挥重要作用。

3、cn101871924a公开了一种同步检测啤酒花中黄腐酚、异黄腐酚和8-异戊烯基柚皮素方法。

4、文献《identification of new phase ii metabolites of xanthohumol in ratin vivo biotransformation of hop extracts using high-performance liquidchromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry》(journal ofchromatography a，2010jun 18；1217(25):4100-8.)报道了采用hplc-q-tof-ms/ms技术研究了黄腐酚在内的啤酒花及其提取物在大鼠体内的生物转化过程，并鉴定出2种ⅰ相代谢物，5种ⅱ相代谢物，其中ⅱ相代谢产物主要为黄腐酚硫酸酯。

5、文献《absorption,metabolism,and pharmacokinetic profile of xanthohumolin rats as determined via uplc-ms/ms》(biopharm drug dispos,2022feb；40(3):289-99)报道了采用uhplc-q-tof-ms/ms技术研究黄腐酚在sd大鼠体内(血浆、尿液、粪便)的吸收以及药物代谢动力学过程，其中发现了6种代谢物，分别为甲基化黄腐酚、黄腐酚葡萄糖醛酸酯、黄腐酚硫酸酯以及酸催化环化和氧化等的黄腐酚代谢物，同时为黄腐酚潜在的临床应用价值提供了参考。

6、文献《metabolism of xanthohumol and isoxanthohumol,prenylatedflavonoids from hops(humulus lupulus l.),by human liver microsomes》(journalof mass spectrometry,2005feb；40:289-299)报道了利用人和大鼠混合肝微粒体研究了黄腐酚和异黄腐酚体外氧化代谢。采用液相色谱/串联质谱法(lc/ms/ms)鉴定代谢物，并与标准品比对，其中鉴定得到了19种化合物，主要为ⅰ相代谢产物。

7、然而，目前，黄腐酚在体内外的代谢过程和代谢产物尚不明确，如何从复杂的生物样品中筛选出代谢物仍然是一个难题，需要继续进一步研究。

技术实现思路

1、本发明的目的是建立一种生物样品中黄腐酚及其体内外代谢产物的检测方法，该方法能够较全面地检测黄腐酚的代谢产物。

2、本发明的目的通过如下技术方案实现。

3、本发明提供一种生物样品中黄腐酚及其体内外代谢产物的检测方法，包括如下步骤：

4、(1)将生物样品进行处理，获得待测溶液；其中，所述生物样品包括生物体吸收黄腐酚后的含有黄腐酚及其代谢产物的含药血浆样品、含药尿液样品、含药粪便样品、含药肝脏样品和/或含药肝微粒体样品；

5、(2)将所述待测溶液采用液相色谱和质谱检测，其中：

6、液相色谱条件为：色谱柱：c18色谱柱；流动相：0.08～0.12vol％甲酸水溶液a与乙腈b；柱温：28～32℃；梯度洗脱程序：0～5min，90～95vol％b；5～10min，95～70vol％b；10～27min，70～50vol％b；27～27.1min，95～10vol％b；27.1～30min，10～95vol％b；流速：0.3～0.33ml/min；

7、质谱条件为：电喷雾离子源为正负离子模式；鞘气流速：40～45arb；辅助气流速：8～15arb；在正离子模式下的喷雾电压为3700～3800v，在负离子模式下的喷雾电压为3450～3500v；毛细管温度：310～320℃；傅里叶高分辨扫描范围m/z：80～1200；一级质谱分辨率：68000～70000；二级质谱分辨率：17200～17500；归一化碰撞能量：15～45％；

8、(3)对质谱解离得到的母离子和碎片离子的分子式进行预测，相关参数设定为：c[5-35]，h[5-60]，o[1-20]，s[0-5]，环和不饱和键数[3-15]，质量精度误差在5ppm以内。

9、根据本发明所述的检测方法，优选地，所述将生物样品进行处理，获得待测溶液的步骤包括：

10、将固相萃取柱用甲醇进行活化，再用水进行平衡至除去甲醇，然后取生物样品加入所述固相萃取柱，依次以水和甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，吹干，残渣用甲醇溶液复溶，涡旋振荡，离心，取上清液作为待测溶液。

11、根据本发明所述的检测方法，优选地，所述将生物样品进行处理，获得待测溶液的具体步骤包括：将固相萃取柱用甲醇进行活化，再用去离子水进行平衡至除去甲醇，然后取0.2～0.5倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以0.6～1倍柱体积的去离子水和0.6～1.5倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，常温下氮气吹干，残渣用0.02～0.1倍柱体积的甲醇复溶，涡旋振荡，离心，取上清液作为待测溶液。

12、根据本发明所述的检测方法，优选地，步骤(1)中，所述固相萃取柱为gracepuretmspe c18-low固相萃取柱；所述色谱柱为waters acquity beh c18色谱柱。

13、根据本发明所述的检测方法，优选地，梯度洗脱程序为：0～5min，95vol％b；5～10min，95vol％～70vol％b；10～27min，70vol％～50vol％b；27～27.1min，95vol％～10vol％b；27.1min～30min，10vol％～95vol％b。

14、根据本发明所述的检测方法，优选地，步骤(2)中，所述柱温为30℃；所述流速为0.3ml/min；进样量为2～3μl。

15、根据本发明所述的检测方法，优选地，所述含药血浆样品由包括以下的步骤制备而得：取血样置于肝素钠离心管中，离心，取上层血浆，得到含药血浆样品。

16、根据本发明所述的检测方法，优选地，所述含药尿液样品由包括以下的步骤制备而得：取尿样离心，取上清，得到含药尿液样品。

17、根据本发明所述的检测方法，优选地，所述含药粪便样品由包括以下的步骤制备而得：将粪样晾干后碾碎，按照1g:4.5～5.5ml的重量体积比的比例加入水，超声处理，离心，取上清液，得到含药粪便样品。

18、根据本发明所述的检测方法，优选地，所述含药肝脏样品由包括以下步骤制备而得：取肝脏组织，加入生理盐水研磨，离心，取上清，得到含药肝脏样品。

19、本发明的检测方法能够对生物样品中的黄腐酚及其众多代谢产物进行有效检测。根据本发明优选的实施方式，能够从含药血浆样品、含药尿液样品、含药粪便样品、含药肝脏样品和含药肝微粒体样品中包括原型在内的53个黄腐酚代谢产物。本发明的检测方法为阐明黄腐酚的体内外代谢机制研究提供了有力支撑。