一种枳实枳壳有效成分含量的测定方法与流程

本发明涉及枳实枳壳有效成分含量测定，特别涉及一种枳实枳壳有效成分含量的测定方法。

背景技术：

1、枳实、枳壳是药用价值很高的中药材，其含有多种有效成分，不同的有效成分有着不同的功效。2020年版药典记载，枳实、枳壳具有破气消积、化痰散痞的功效，可用于积滞内停，痞满胀痛，泻痢后重，大便不通，痰滞气阻，胸痹、结胸、脏器下垂的治疗；一些学者认为枳实中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷能够有效改善小鼠肠黏膜炎，其机制可能与抗氧化、抗炎、调节肠道菌群有关；研究显示圣草次苷可通过减少促炎细胞因子表达，抑制心肌细胞凋亡，从而在大鼠缺血再灌注心肌损伤中发挥心肌保护作用；枳实可以通过多种途径对功能性消化不良起到治疗作用；新橙皮苷能够部分抑制前脂肪细胞分化和胞内脂质积累，并且显著降低脂肪细胞分化；有研究显示，枸橘苷能抑制骨肉瘤细胞的增殖，增加其自噬通量。可见，枳实、枳壳有着相当高的药用价值，有着很广阔的应用前景，对枳实、枳壳进行开发利用及全面质量评价必须对其各有效成分进行检测。

2、目前大量对枳实枳壳药材的研究，发现它们均能检出圣草次苷、新北美圣草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷、柚皮素、橙皮素、橙皮内酯、川陈皮素、桔红素这12种有效成份。按现有检测方法，每个样品要完成上述12种有效成分的检测，均需采用多种不同的液相色谱方法，检测过程繁琐，检测效率很低，不仅耗费了大量的时间、精力、试剂和耗材，而且还会在检测过程中产生大量的有机废液。当下缺少一种简便的能同时测定这12种有效成分的方法。这12种有效成分均为黄酮类物质，有着相同的官能团，这使得用同一种方法进行检测，实现工作量呈指数级减少成为可能。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种枳实枳壳有效成分含量的测定方法，具体技术方案如下：

2、s1：配制对照品溶液，在不同的流动相比例浓度下，对混合对照品工作溶液和单个对照品工作溶液进行等度洗脱，获取各有效成分的洗脱顺序和对应的流动相的比例浓度。

3、进一步的，所述对照品溶液，包括单个对照品储备溶液、单个对照品工作溶液和混合对照品工作溶液。

4、优选的，所述单个对照品储备溶液的配制过程如下：

5、分别精密称取圣草次苷、新北美圣草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷、柚皮素、橙皮素、橙皮内酯、川陈皮素、桔红素对照品各10mg精确至(0.00001g)于12个的10ml容量瓶中，分别加入甲醇溶液充分溶解后定容至刻度，摇匀，获得浓度均为1.0mg/ml的单个对照品储备溶液。

6、优选的，所述单个对照品工作溶液的配制过程如下：

7、分别吸取所述单个对照品储备溶液各1ml于12个20ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，获得浓度为50μg/ml的单个对照品工作溶液。

8、优选的，所述混合对照品工作溶液的配制过程如下：

9、分别吸取所述单个对照品储备溶液各1ml于同一个20ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，获得所述浓度为50μg/ml的12种有效成分的混合对照品工作溶液。

10、进一步的，所述流动相为0.1％甲酸水溶液+乙腈，通过设置多组不同比例浓度的流动相(0.1％甲酸水溶液+乙腈比例浓度分别为20+80，30+70，40+60，50+50，60+40，70+30，80+20，90+10)，对12种有效成分的混合对照品工作溶液和单个对照品工作溶液分别进行等度洗脱。

11、获得12种有效成分洗脱顺序为：圣草次苷、新北美圣草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷、柚皮素、橙皮素、橙皮内酯、川陈皮素、桔红素；

12、圣草次苷、新北美圣草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷洗脱时流动相中乙腈浓度为20％左右；枸橘苷洗脱时流动相中乙腈浓度为30％左右；柚皮素、橙皮素洗脱时流动相中乙腈浓度为40％左右；橙皮内酯、川陈皮素洗脱时流动相中乙腈浓度为50％左右；桔红素洗脱时流动相中乙腈浓度为60％左右。

13、s2：采用正交实验方法，对混合对照品工作溶液进行梯度洗脱，得到最佳梯度洗脱条件，建立检测方法；

14、进一步的，所述正交实验包括四因素和三水平进行正交，所述四因素包括：乙腈起始浓度，第一梯度终点乙腈浓度、第二梯度终点乙腈浓度以及柱温。

15、优选的，所述三水平包括：乙腈起始浓的三水平18％，20％，22％；第一梯度终点乙腈浓度的三水平20％，22％，24％；第二梯度终点乙腈浓度的三水平58％，60％，65％；柱温的三水平25℃，30℃，35℃。

16、进一步的，基于所述正交实验获得各有效成分的信噪比以及分离度，利用方差进行分析，获得最佳梯度洗脱条件如下：

17、流动相a为0.1％甲酸水溶液，流动相b为乙腈。洗脱梯度：0～25min，流动相b浓度从18％增至20％；25min～65min，流动相b浓度从20％增至62％；65min～66min，流动相b浓度从62％降至18％；66min～81min，流动相b浓度18％。柱温为30℃。

18、进一步的，建立的检测方法为：

19、准备仪器和设备：高效液相色谱仪(带二级管阵列检测器)、十万分之一电子天平，超声波提取仪。

20、设定检测条件，包括色谱条件：色谱柱为agilent zorbax sb-c18 4.6μm×250mm或相当者；梯度洗脱条件设定为所述最佳梯度洗脱条件；检测波长为283nm和330nm；流速为1.0ml/min；进样体积为10μl。

21、配制试剂：包括对照品溶液的配制，校准曲线溶液的配制和供试品溶液的配制。

22、配制校准曲线溶液：通过稀释混合对照品工作溶液和单个对照品储备溶液，分别配制出圣草次苷、柚皮素、橙皮素、橙皮内酯、川陈皮素、桔红素浓度在0.15μg/ml-50μg/ml的校准曲线溶液；新北美圣草苷、芸香柚皮苷、橙皮苷、枸橘苷浓度在0.15μg/ml-100μg/ml的校准曲线溶液；柚皮苷、新橙皮苷浓度在0.15μg/ml-600μg/ml的校准曲线溶液；

23、配制供试品溶液：分别精密称取过四号筛的枳实0.05g和枳壳0.1g精确至(0.0001g)，分别置于两个20ml容量瓶中，加甲醇15ml超声提取30分钟，冷却至室温后，甲醇定容至刻度，摇匀，用0.45μm的滤膜过滤，取续滤液即得；

24、将配置的校准曲线溶液和供试品溶液，按上述色谱条件进行检测；用已知浓度的校准曲线溶液所测得的峰面积为纵坐标，其浓度为横坐标，绘制出各成分的标准曲线；用供试品溶液测得的峰面积在标准曲线上读出各成分的浓度，再通过计算，即可得到各有效成分的含量。

25、进一步的，还包括步骤s3：基于建立的检测方法，进行方法验证。

26、进一步的，所述方法验证包括对专属性、线性、范围、检测限、定量限、精密度、重复性、稳定性、重现性、加样回收率进行验证。

27、进一步的，步骤s3之后，还包括步骤s4：基于建立的检测方法，检测枳实枳壳样品中12种有效成分的含量。

28、本发明的有益效果如下：

29、能够通过一次检测就同时准确检测出一个样品中12种有效成分的含量，方便快捷，进而在实际中能够提高枳实枳壳药材和部分中成药的质量验证或评价的效率和准确率。