一种基于三维纳米探针增强探测极限的光学微腔核酸传感器和方法

本发明涉及一种基于三维纳米探针增强探测极限的光学微腔核酸传感器和方法，属于生物光学传感。

背景技术：

1、核酸检测有多种方法，如pcr技术、抗体检测和直接核酸检测等。然而，标记过程聚合酶链反应(pcr)技术的假阴性率很高、时间长且检测成本高。至于抗体检测方法，准确度不太令人满意，只有在免疫系统做出反应后才能检测到。

2、dna序列的互补杂交用于检测病毒(或rna)本身，因此核酸检测方法具有快速识别的能力。当前对于dna序列的检测大多使用电化学、荧光标记和微纳光纤生物传感技术等。电化学和荧光标记技术需要对核酸分子进行复杂的生化处理；此外，荧光标记耗时且容易干扰分析过程，这限制了低浓度核酸分子检测的性能。微纳光纤有限的互作用长度限制了其检测极限的进一步降低。而光学微腔传感器因其具有小模式体积、高腔内光子数密度、强光与物质互作用强度等优势，有望成为克服上述限制的有效方法。首先，与传统的光学设备相比，光学微腔是一种尺寸在微纳米级别的光学环形谐振腔，光在谐振器内进行了多次循环，这显著增强了光与周围环境的相互作用，从而提高了检测的灵敏度。其次，具有高q值的光学微腔的频谱带宽极窄，使得检测谐振波长更容易分辨细微的变化，从而极大地提高了检测极限。另外，光学微腔材料多为二氧化硅，因此不需要考虑电化学检测时金基板上的强荧光猝灭效应，而且也可以进一步降低实际的检测成本。但该装置在检测过程中稳定性仍需要进一步进行提升。

3、传统的核酸分子检测通常以单链dna分子作为探针。然而，单链dna分子在自组装过程中存在静电排斥力、dna链与传感界面的非特异性吸附作用力、单链间的碱基堆积作用力等，这些作用力会导致杂交所需活化能更大，杂交速率会随之降低。同时，探针分子与传感器表面结合效率仍需要进一步进行提升。

技术实现思路

1、本发明目的在于针对上述现有技术的缺陷和不足，提供了一种基于三维纳米探针增强探测极限的光学微腔核酸传感器和方法，该系统包括可调谐窄带激光器、衰减器、偏振控制器、核酸传感单元、光电探测器和反馈系统。利用光学微腔高q值回音壁模共振与三维纳米探针结合，实现核酸分子的低探测极限检测。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于三维纳米探针增强探测极限的光学微腔核酸传感器，该传感器包括可调谐窄带激光器、衰减器、偏振控制器、核酸传感单元、光电探测器和反馈系统，所述核酸传感单元是由纳米级尺寸三维纳米探针可控、有序、均匀功能化修饰其表面的光学微腔，由微纳光波导与其倏逝场耦合可激发高q值回音壁模共振光谱，光学微腔与微纳光波导耦合输入端依次连接窄线宽可调谐光纤激光器、偏振控制器和衰减器，输出端接光电探测器和反馈系统。

3、进一步地，本发明通过纳米级尺寸三维纳米探针在光学微腔表面有序、可控、均匀自组装和功能化，结合光学微腔高q值wgm光场对表面折射率、厚度变化的高度敏感特性，实现无标记、快速、低探测极限的核酸传感，当核酸分子在光学微腔传感功能界面特异性结合时，通过实时监测微腔wgm光谱测试在核酸分子特异性结合过程中的变化，实现无标记、快速核酸分子传感，再通过三维纳米探针的特殊多维、可控、纳米级尺寸的空间构象实现低检测极限(am级)、高特异性核酸分子传感。

4、进一步地，本发明通过在微腔的微流体通道内激发和实时测试高q因子>107的回音壁模共振光谱进行核酸分子检测，回音壁模共振光场与微腔表面待测核酸样本发生特异性生物光学互作用，实现了～am的超低检测极限(与使用1d ssdna探针相比，检测极限低约1000倍)和～nl的小样品体积检测核酸传感，并且能够高度特异的检测单碱基失配。

5、进一步地，本发明通过将光学微腔与微纳光波导整体封装于设计的封装结构中以提高系统的稳定性即振动、温度外界影响。

6、进一步地，本发明能够实现～am浓度的超低探测极限核酸分子检测以及高特异性单核酸碱基失配识别。

7、进一步地，本发明三维纳米探针具有可调控传感界面，通过物理吸附或化学键结合等方法结合于光学微腔表面，所述三维纳米探针具有2个及以上的维度。

8、进一步地，本发明表面的三维纳米探针与目标核酸分子的互作用处于光学微腔内表面或者外表面回音壁模共振光场的激发区域，通过回音壁模式大光子密度特性增强光场对核酸分子互作用的感知强度。

9、进一步地，本发明被测核酸分子与三维纳米探针通过特异性结合改变微腔表面介质折射率和厚度，从而产生能随生物反应过程实时变化的光学微腔回音壁模共振光谱特性。

10、本发明还提供了一种基于三维纳米探针增强探测极限的光学微腔核酸传感器的实现方法，该方法包括如下步骤：

11、步骤1：清洗光学微腔；

12、向光学微腔内部通入去离子水以达到清洗作用；

13、步骤2：羟基化表面；

14、对经上述步骤1清洗后的光学微腔内部通入食人鱼溶液，将液体封存于光学微腔内并静置30min，在静置过程中通过温控箱对光学微腔进行70℃的温控处理以更好地羟基化表面，结束后用去离子水将光学微腔内洗涤干净；

15、步骤3：将多聚赖氨酸溶液通入光学微腔内静置1h，静置结束后用去离子水洗涤，去除光学微腔内多余的多聚赖氨酸溶液；

16、步骤4：将三维纳米探针通入光学微腔内静置1h，使得探针结合到表面功能化的光学微腔内壁表面，结束后向光学微腔内通入去离子水，清洗光学微腔内部。

17、优选地，在步骤2步骤中，通入的食人鱼溶液是浓硫酸/30％ h2o2以体积比3：1制备；在步骤4步骤中，通入的三维纳米探针的浓度为1μm。

18、进一步地，本发明三维纳米探针通过“自下而上”的策略自组装而成，由tetra-a、tetra-b、tetra-c和tetra-d四条链通过自组装方法合成制备，将tetra-a、tetra-b、tetra-c和tetra-d四条链等摩尔浓度体积与tm buffer(20mm tris，50mm mgcl2)混合至最终浓度为1μm，并将混合溶液加热到95℃中放置10min，随后冷却到4℃孵育30min。

19、进一步地，本发明三维纳米探针与功能化光学微腔内表面的连接步骤为：功能化光学微腔表面羟基与pll中的氨基结合，然后再与三维纳米探针结构底端的三个氨基-nh-nh-连接。

20、进一步地，本发明三维纳米探针形成过程采用琼脂凝胶电泳进行表征。

21、进一步地，本发明三维纳米探针与功能化光学微腔表面结合密度和均匀性采用激光共聚焦荧光显微镜(fv1000mpe)进行测试。

22、进一步地，本发明三维纳米探针与表面功能化的光学微腔内壁的结合效率以及光学微腔内框架核酸探针与目标核酸分子的结合效率采用荧光分光光度计(rf-6000plus)进行测量。

23、进一步地，本发明通过载玻片、聚四氟乙烯毛细软管和紫外胶对耦合单元(光学微腔和微纳光波导)进行稳定性封装处理。

24、有益效果：

25、1、本发明采用的是具有纳米尺寸的三维纳米探针，具有制备简单、结构稳定性好、尺寸可程序化调控和抗非特异性吸附能力优异等特点。通过三维纳米探针的特殊多维、可控、纳米级尺寸的空间构象，减少核酸分子敏感探针在光学微腔表面的倒伏和缠绕，提高探针和目标核酸分子的结合效率，实现低检测极限(am级)、高特异性核酸分子传感。三维纳米探针三维纳米探针具有2个及以上的维度，制备简单、结构稳定性好、尺寸可程序化调控和抗非特异性吸附能力优异等特点，相比于单链探针，其具有可更好的传感界面调控能力，通过物理吸附或化学键结合等方法结合于光学微腔表面，大大提高了探针结合的均匀性和有效性。

26、2、本发明表面三维纳米探针与目标核酸分子的互作用处于光学微腔表面回音壁模共振光场的激发区域，通过回音壁模式大光子密度特性增强光场对核酸分子互作用的感知强度。结合光学微腔高q值wgm光场对表面折射率、厚度变化的高度敏感特性，实现无标记、快速、低探测极限的核酸传感。当核酸分子在光学微腔传感功能界面特异性结合时，通过实时监测微腔wgm光谱测试在核酸分子特异性结合过程中的变化，实现无标记、快速核酸分子传感；回音壁模共振光场与微腔表面待测核酸样本发生特异性生物光学互作用，实现了～am的超低检测极限(与使用1d ssdna探针相比，检测极限低约1000倍)和～nl的小样品体积检测核酸传感，能够高度特异地识别单碱基失配。

27、3、本发明采用载玻片、聚四氟乙烯毛细软管和紫外胶对耦合单元进行处理，不需要额外设计微流控装置，极大的降低了传感器设计的成本。传感单元空心光学微腔，具有双流体输入/输出通道，可以填充液体或气体，这使其在分析物输送方面具有明显的优势，尤其是它用于与微流体系统集成的各种超灵敏无标记生化检测方法，并同时具有安全、成本低廉和制备简单的工艺优势。