食物过敏原嗜碱性粒细胞活化检测方法及其应用与流程

本发明涉及医学检测领域，具体地涉及一种嗜碱性粒细胞活化检测方法及其应用。

背景技术：

1、过敏性疾病是临床常见病。据who统计，全球约22％人群受到过敏性疾病的干扰，且发病人数呈逐年上升趋势，给社会带来了沉重的经济负担。

2、过敏性疾病的临床症状常常缺乏特异性，这给临床诊断带来了困难。目前临床上对于过敏性疾病的诊断，除了病史、体格检查外，实验室检查是重要辅助诊断手段。

3、目前常用的实验室检查主要是检测过敏原，包括体内激发试验和体外过敏原特异性ige检测(sige)以及血清总ige检测。体内试验虽然准确性较高，但存在诱发严重过敏反应的风险，多种抗原过敏时的交叉反应结果也难以判断，而且检测时患者尤其是儿童比较痛苦。

4、体外试验中总ige水平受多种因素影响，特异性较低。目前，过敏原sige检测是过敏性疾病诊断应用最广泛的检测手段。但是，由于ige的血清浓度很低(大约为igg的3-7万分之一)，因此，检测难度大，且能够检测的过敏原有限(约30-40种)。此外，过敏原特异性ige结果并不能反应患者的体内状态。

5、因此，临床迫切需要开发有效和可靠地对过敏性疾病进行体外检测的方法(包括实验室检查方法)。

技术实现思路

1、本发明的目的就是提供了一种有效和可靠地对过敏性疾病进行体外检测的方法。

2、具体地，本发明提供了一种嗜碱性粒细胞活化检测方法和相应的检测试剂，为过敏性疾病诊断、过敏原和其组分的筛查等提供了新的解决方案，并可应用于过敏严重程度的预测和疗效的监测。

3、在本发明的第一方面，提供了一种用于嗜碱性粒细胞活化检测的试剂组合，其中，所述试剂组合包括：抗人cd203c的第一抗体、抗人cd123的第二抗体、抗人cd45的第三抗体、抗人cd63的第四抗体、阳性对照品，和过敏原。

4、在另一优选例中，所述试剂组合还包括刺激缓冲液和/或终止缓冲液。

5、在另一优选例中，所述的试剂组合还包括选自下组的一种或多种试剂：染色试剂稀释液、红细胞裂解液、洗涤液。

6、在另一优选例中，所述刺激缓冲液含有hank's平衡盐缓冲液、nahco3和hepes缓冲液。

7、在另一优选例中，所述的刺激缓冲液ph值为7.2-7.5(较佳地7.35-7.45)。采用的保存条件为4℃。

8、在另一优选例中，所述的过敏原包括已发现的天然过敏原粗提物、提纯的天然过敏原组分、重组的过敏原组分，或其组合。

9、在另一优选例中，所述的过敏原选自下组：尘螨(躯体、蜕皮、排泄物等等)、蟑螂、德国小蠊(唾液、排泄物、胃肠道分泌物、皮屑、蜕皮、虫尸、甲壳、被其咬过的东西、被其粪便污染过的地方等等)、艾蒿、烟曲霉、狗毛屑、猫皮屑、花粉、真菌(菌丝、孢子等)、柳絮(吸入性过敏原)；昆虫毒液(接触过敏原/注入性过敏原)；虾、小麦、黑麦、大麦、燕麦、玉米、花生、鱼、蟹、鸡蛋、牛奶、芝麻、大豆、普通豚草、藜、苍耳、坚果类、香菇、海鲜、芒果、猕猴桃、菠萝(食物)；抗生素、生物制品(药物/注入性过敏原)，或其组合。

10、在另一优选例中，所述的过敏原包括食物或药物。

11、在另一优选例中，所述的药物包括：抗感染类药物、麻醉药及其辅助药物、神经类药物、精神类药物、抗肿瘤类药物、心血管类药物、呼吸类药物、消化类药物、泌尿系统类药物等等。

12、在另一优选例中，所述的药物包括：β-内酰胺酶类药物(包括青霉素、头孢菌素、头霉素类等)、神经肌肉阻滞剂(nmbas)类药物(麻醉剂)(包括琥珀胆碱、潘库溴铵、筒箭毒碱、阿曲库铵、维库溴铵、罗库溴铵、美维松等)、喹诺酮类药物(包括环丙沙星、莫西沙星、左氧氟沙星等)、非甾体抗炎药物(包括阿司匹林、布洛芬、双氯芬酸、保泰松、对乙酰氨基酚、吲哚美辛、萘普生等)、碘化造影剂类药物(包括碘化钠、泛影葡胺、欧乃派克、碘蕃酸、胆影葡胺等)、生物制剂类药物(包括单克隆抗体、融合蛋白、细胞因子等)。

13、在另一优选例中，所述的过敏原包括吸入性过敏原、注入性过敏原、涂抹/接触过敏原、经口/口服过敏原。

14、在另一优选例中，所述的过敏原包括经皮或透皮过敏原。

15、在另一优选例中，所述的吸入性过敏原包括：花粉、真菌、尘螨、动物性过敏原(猫、狗、豚鼠、马、兔等等，例如动物的毛发、皮屑，还包括皮脂腺、唾液腺和肛周腺体等)。

16、在另一优选例中，所述的注入性过敏原包括昆虫注入性过敏原(例如昆虫毒液)，所述昆虫包括蜜蜂、马蜂、黄蜂、蚂蚁、蚊子等。

17、在另一优选例中，所述的注入性过敏原为肽类，优选地为蜂毒多肽。

18、在另一优选例中，所述的蜂毒多肽包括：蜂毒肽素(melittin)、蜂毒明胶(apamin)、肥大细胞脱细胞肽(mcdp)、安度拉平(adolapin)、或其组合。

19、在另一优选例中，所述的过敏原选自下组：尘螨(如户尘螨、粉尘螨)、蟑螂、德国小蠊、狗毛屑、猫皮屑、牛奶、鸡蛋、抗生素，或其组合。

20、在另一优选例中，所述的过敏原包括尘螨过敏原(如尘螨过敏原粗提物和重组尘螨过敏原主要组分der f2)。

21、在另一优选例中，所述的过敏原的浓度为0.01-20μg/ml，较佳地0.05-15μg/ml，更佳地0.1-10μg/ml。

22、在另一优选例中，所述终止缓冲液包括含有edta或其盐的pbs缓冲液。

23、在另一优选例中，所述的终止缓冲液中edta或其盐的浓度为5-20mmol/l，ph为7.2-7.5(较佳地7.35-7.45)。

24、在另一优选例中，所述的阳性对照品选自下组：抗人ige抗体、fmlp，或其组合。

25、在另一优选例中，所述的阳性对照品为双阳性对照品，包括抗人ige抗体和fmlp。

26、在另一优选例中，所述的人ige来自过敏患者的ige(如过敏原特异性ige(sige)、或血清总ige)。

27、在另一优选例中，所述的抗人ige抗体浓度为0.1-20μg/ml，较佳地0.5-15μg/ml，更佳地1-10μg/ml。

28、在另一优选例中，所述的第一抗体、第二抗体、第三抗体、和第四抗体带有不同的荧光标记。

29、在另一优选例中，所述的带有不同荧光标记的检测抗体(即第一抗体、第二抗体、第三抗体、和第四抗体)分别作为染色试剂。

30、在另一优选例中，所述的荧光标记分子选自下组：fitc、pe、ecd、percp-cyanine5.5、pe-cyanine、apc-alexa 750、apc、alexa 染料、pacificblue、ko、或其组合。

31、在另一优选例中，所述的染色试剂稀释液由含有bsa的pbs缓冲液组成。

32、在另一优选例中，所述的红细胞裂解液含有碳酸氢钾、氯化氨和edta-na2。

33、在另一优选例中，所述的洗涤液由含有bsa的pbs缓冲液组成。

34、在本发明的第二方面，提供了一种嗜碱性粒细胞活化的体外检测方法，其中，所述方法包括如下步骤：

35、(a)提供一待检测的样品，所述的样品为抗凝全血，并将所述抗凝全血分为n份，n为≥3的正整数(如3-10份，例如3、4、5、6份)；

36、(b)设置阴性对照组、阳性对照组和活化测试组，并添加所述的抗凝全血，形成测试混合物，并对所述测试混合物进行刺激孵育；

37、其中，所述阴性对照组、阳性对照组和活化测试组的测试条件相同，不同点在于：在阳性对照组中，至少一份所述的抗凝全血与阳性对照品一起进行孵育；在活化测试组中，至少一份所述的抗凝全血与过敏原一起进行孵育；而在阴性对照组中，至少一份所述的抗凝全血在无阳性对照品和无过敏原存在下进行孵育；

38、(c)对所述阴性对照组、阳性对照组和活化测试组中各自的测试混合物进行测定，以确定阴性对照组、阳性对照组和活化测试组中的目标嗜碱性粒细胞，其中，所述的目标嗜碱性粒细胞为cd203c+cd123+cd45+sslow型细胞；并确定所述目标嗜碱性粒细胞中cd63+的细胞数量和/或比例；和

39、(d)对阴性对照组、阳性对照组和活化测试组的cd63+的细胞数量和/或比例进行比较，从而定性和/或定量地确定待检测的样品中的嗜碱性粒细胞的活化程度。

40、在另一优选例中，所述阳性对照组包括抗人ige抗体阳性对照组和/或fmlp阳性对照组；

41、较佳地，步骤(a)中所述n＝4，并且步骤(b)中所述阳性对照组包括阳性对照组a和阳性对照组b，其中阳性对照组a中的阳性对照品为抗人ige抗体，阳性对照组b中的阳性对照品为fmlp。

42、在另一优选例中，在步骤(b)中，所述刺激孵育的时间t1为10-45分钟，较佳地15-30分钟，更佳地15-25分钟。

43、在另一优选例中，在步骤(d)中，包括计算阳性对照组的第一si值和活化测试组的第二si值，其中，

44、第一si值如下计算：si＝阳性对照组的活化嗜碱性粒细胞百分比/阴性对照组活化嗜碱性粒细胞百分比；而且

45、第二si值如下计算：si＝活化测试组中刺激后的活化嗜碱性粒细胞百分比/阴性对照组活化嗜碱性粒细胞百分比；

46、或者

47、第一si值如下计算：si＝阳性对照组的活化嗜碱性粒细胞数量/阴性对照组活化嗜碱性粒细胞数量；而且

48、第二si值如下计算：si＝活化测试组中刺激后的活化嗜碱性粒细胞数量/阴性对照组活化嗜碱性粒细胞数量。

49、在另一优选例中，所述活化嗜碱性粒细胞数量由嗜碱性粒细胞cd63平均荧光强度确定。

50、在另一优选例中，所述第一si值＝阳性对照组的嗜碱性粒细胞cd63平均荧光强度/阴性对照组的嗜碱性粒细胞cd63平均荧光强度。

51、在另一优选例中，所述第二si值＝活化测试组中刺激后的嗜碱性粒细胞cd63平均荧光强度/阴性对照组的嗜碱性粒细胞cd63平均荧光强度。

52、在另一优选例中，在步骤(d)中，包括计算阳性对照组的z1值和活化测试组的z2值，其中，

53、z1值如下计算：z1＝阳性对照组的活化嗜碱性粒细胞百分比-阴性对照组活化嗜碱性粒细胞百分比；而且

54、z2值如下计算：z2＝活化测试组中刺激后的活化嗜碱性粒细胞百分比-阴性对照组活化嗜碱性粒细胞百分比。

55、在另一优选例中，当z1≥5％且第一si值si-1≥2时，认定实验检测有效，否则实验无效。

56、在另一优选例中，当z2≥5％且第二si值si-2≥2时，判断作为所述样品来源的受试者为过敏患者或过敏高风险群体，否则判断为非过敏患者或过敏低风险群体。

57、在另一优选例中，所述的定性和/或定量包括确定：待检测的样品中的嗜碱性粒细胞是否活化，和/或活化程度。

58、在另一优选例中，在步骤(c)中，通过流式细胞术确定阴性对照组、阳性对照组和活化测试组中的目标嗜碱性粒细胞。

59、在另一优选例中，在步骤(c)中，还包括：确定阴性对照组、阳性对照组和活化测试组中的目标嗜碱性粒细胞数量和/或比例。

60、在另一优选例中，所述的阳性对照品选自下组：抗人ige抗体、fmlp，或其组合。

61、在另一优选例中，所述的人ige为过敏患者的ige(如过敏原特异性ige(sige)、或血清总ige)。

62、在另一优选例中，所述的抗凝全血为肝素抗凝全血。

63、在步骤(b)中，在阴性对照组、阳性对照组和活化测试组中，在各测试管中分别添加50-500μl的抗凝全血,然后分别添加刺激缓冲液，或添加阳性对照品+刺激缓冲液，或添加过敏原+刺激缓冲液；

64、在另一优选例中，所述方法包括以下步骤：

65、(1)提供样品：新鲜的肝素抗凝全血(最好不超过24h)，较佳地体积为1-5ml；

66、(2)分组并进行刺激：取流式管，分3管，分别为阴性对照管、阳性对照管和测试管；各管先加入肝素抗凝血，再将阳性对照品和过敏原用刺激缓冲液稀释到0.1-10μg/ml，再分别将刺激缓冲液、稀释的阳性对照品和过敏原分别加入阴性对照管、阳性对照管和测试管中，在37±2℃下刺激一段时间t1(较佳地t1为15-30min)；

67、(3)终止检测：加入终止缓冲液，离心(200g，10min)，吸去上清，重悬细胞；

68、(4)标记抗体：用染色试剂稀释液稀释荧光标记抗体，加入荧光标记抗体，避光孵育一段时间t2(较佳地t2为25-40min)；

69、(5)裂解红细胞：加入红细胞裂解液，裂解红细胞，加入洗涤液洗涤，离心后收集细胞沉淀，所述细胞沉淀为含有嗜碱性粒细胞的细胞群；

70、(6)加入洗涤液重悬细胞沉淀，并对重悬的细胞进行流式细胞术检测，从而确定目标嗜碱性粒细胞，所述的目标嗜碱性粒细胞为cd203c+cd123+cd45+sslow型细胞；

71、(7)确定所述目标嗜碱性粒细胞中cd63+的细胞数量和/或比例；和

72、(8)对阴性对照组、阳性对照组和活化测试组的cd63+的细胞数量和/或比例进行比较，从而定性和/或定量地确定待检测的样品中的嗜碱性粒细胞的活化程度。

73、在另一优选例中，所述方法包括以下步骤：

74、(1)提供样品：新鲜的肝素抗凝全血(最好不超过24h)，较佳地体积为1-5ml；

75、(2)分组并进行刺激：取流式管，分4管，分别为阴性对照管、阳性对照管a、阳性对照管b和测试管；各管先加入肝素抗凝血，再将阳性对照品a、阳性对照品b和过敏原用刺激缓冲液稀释到0.1-10μg/ml，再分别将刺激缓冲液、稀释的阳性对照品a、稀释的阳性对照品b和过敏原分别加入阴性对照管、阳性对照管a、阳性对照管b和测试管中，在37±2℃下刺激一段时间t1(较佳地t1为15-30min)；

76、(3)终止检测：加入终止缓冲液，离心(200g，10min)，吸去上清，重悬细胞；

77、(4)标记抗体：用染色试剂稀释液稀释荧光标记抗体，加入荧光标记抗体，避光孵育一段时间t2(较佳地t2为25-40min)；

78、(5)裂解红细胞：加入红细胞裂解液，裂解红细胞，加入洗涤液洗涤，离心后收集细胞沉淀，所述细胞沉淀为含有嗜碱性粒细胞的细胞群；

79、(6)加入洗涤液重悬细胞沉淀，并对重悬的细胞进行流式细胞术检测，从而确定目标嗜碱性粒细胞，所述的目标嗜碱性粒细胞为cd203c+cd123+cd45+sslow型细胞；

80、(7)确定所述目标嗜碱性粒细胞中cd63+的细胞数量和/或比例；和

81、(8)对阴性对照组、阳性对照组a、阳性对照组b和活化测试组的cd63+的细胞数量和/或比例进行比较，从而定性和/或定量地确定待检测的样品中的嗜碱性粒细胞的活化程度。

82、在另一优选例中，在步骤(d)中，如果阳性对照组的第一si值≥2且绝对活化嗜碱性粒细胞百分比≥5％，则认为测试是质控合格的；并且如果活化测试组的第二si值≥2且绝对活化嗜碱性粒细胞百分比≥5％，则给出阳性测试结果，即嗜碱性粒细胞是活化的或可活化的。

83、在另一优选例中，在步骤(d)中，所述阳性对照组包括抗人ige抗体阳性对照组和fmlp阳性对照组；如果其中任一阳性对照组中的第一si值≥2且绝对活化嗜碱性粒细胞百分比≥5％，则认为测试是质控合格的；并且如果活化测试组的第二si值≥2且绝对活化嗜碱性粒细胞百分比≥5％，则给出阳性测试结果，即嗜碱性粒细胞是活化的或可活化的。

84、在另一优选例中，在活化测试组中，所述的绝对活化嗜碱性粒细胞百分比＝活化测试组中刺激后的活化嗜碱性粒细胞百分比-阴性对照组活化嗜碱性粒细胞百分比。

85、在另一优选例中，在阳性对照组中，所述的绝对活化嗜碱性粒细胞百分比＝阳性对照组的活化嗜碱性粒细胞百分比-阴性对照组活化嗜碱性粒细胞百分比。

86、在另一优选例中，活化嗜碱性粒细胞包括cd63+嗜碱性粒细胞。

87、在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性的。

88、在本发明的第三方面，提供了如本发明第一方面所述的用于嗜碱性粒细胞活化检测的试剂组合的用途，它被用于制备一检测试剂盒，所述试剂盒用于

89、(a)过敏性疾病诊断或过敏原的鉴别；

90、(b)用于过敏严重程度的分析；

91、(c)对于过敏疾病或其易感性的筛查；和/或

92、(d)对过敏疾病的疗效的监测。

93、在另一优选例中，所述的过敏性疾病包括过敏性哮喘、鼻炎、皮炎等各种与过敏相关的疾病。

94、在另一优选例中，所述试剂盒中还包括一说明书，所述说明书中记载了本发明第二方面所述的方法。

95、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。