一种用于检测儿茶精的“关-开”荧光探针及其制备方法和应用

本发明属于药物分析的，具体涉及一种用于检测儿茶精的“关-开”荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

1、儿茶素是天然多酚化合物，黄烷-3-醇(或黄烷醇)，属于类黄酮家族。它们在各种水果、蔬菜和植物性饮料中含量很高。儿茶素具有强大的抗氧化特性，在某些情况下，它们可在细胞中作为促氧化剂起作用。儿茶素是活性氧(ros)清除剂和金属离子螯合剂，而其间接抗氧化活性，包括诱导抗氧化酶，抑制促氧化酶。儿茶精可以降低患几种癌症的风险，心血管疾病，慢性病以及痴呆。因此，一种简单可靠的儿茶精检测分析方法是迫切需要的。近年来，已经开发了许多分析方法来确定儿茶精含量，包括高效液相色谱、气相色谱和毛细管电泳等，这些方法往往存在操作复杂，或仪器昂贵或检测受环境干扰较大的缺点。随着时代的发展，对设计简单灵敏的儿茶精生物探针有强烈的需求。

技术实现思路

1、发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于检测儿茶精的适配体修饰的bodipy-mwcnts的“关-开”荧光探针的制备方法，本发明制备的探针可以有效解决现有儿茶精检测操作复杂，或仪器昂贵或检测受环境干扰较大的缺点。

2、本发明还提供所制备的荧光探针及其在检测儿茶精中的应用。

3、技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种用于检测儿茶精的“关-开”荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

4、(1)将4-羧基苯甲醛、2，4-二甲基吡咯、二氯甲烷、三氟乙酸、四氯苯醌、三乙胺、醚合三氟化硼反应后制得bodipy；

5、(2)将多壁碳纳米管粉末超声分散至纯水中得到碳纳米管分散液；

6、(3)将bodipy溶液，儿茶精适配体、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺反应得到适配体修饰的bodipy溶液；

7、(4)将儿茶精适配体修饰的bodipy溶液和多壁碳纳米管分散液混合反应制得bodipy-mwcnts探针。

8、其中，步骤(1)中将4-羧基苯甲醛溶解在二氯甲烷中，之后向混合物中加入2，4-二甲基吡咯和滴加三氟乙酸，将反应物在室温下搅拌12-15h再加入氧化剂四氯苯醌反应5-6h；然后加入三乙胺反应30-50min后，继续加入醚合三氟化硼，室温搅拌过夜，粗品经硅胶柱层析法纯化得到固体bodipy。

9、作为优选，步骤(1)中将4-羧基苯甲醛溶解在二氯甲烷中，之后向混合物中加入2，4-二甲基吡咯和3-4滴三氟乙酸，在此过程中可以观察到明显的颜色变化，将反应物在室温下搅拌12h；随后，向混合物中加入氧化剂四氯苯醌反应5h，然后恒压加入三乙胺，30min后在相同环境下加入醚合三氟化硼，室温搅拌过夜；最后，粗品经硅胶柱层析法纯化得到粉红色固体bodipy。

10、其中，步骤(1)中4-羧基苯甲醛、2，4-二甲基吡咯、四氯苯醌的摩尔比是6-7：13-15：6-7；二氯甲烷、三乙胺、醚合三氟化硼的体积比是10-13：1：1。

11、作为优选，步骤(1)中4-羧基苯甲醛：2，4-二甲基吡咯，四氯苯醌的摩尔比是6.7：14.7：6.7，二氯甲烷：三乙胺：醚合三氟化硼的体积比是10：1：1。

12、其中，步骤(1)中的bodipy固体溶于乙醇得到bodipy溶液。

13、作为优选，步骤(1)中bodipy固体溶于无水乙醇得到bodipy溶液。

14、其中，步骤(2)中的将多壁碳纳米管粉末超声30-50min分散至纯水中。

15、作为优选，步骤(2)中将多壁碳纳米管粉末超声40min分散至纯水中。

16、其中，步骤(3)中向bodipy溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺，搅拌1-2h后，向其中加入儿茶精适配体溶液，继续反应4-6h得到适配体修饰的bodipy溶液。

17、作为优选，步骤(3)中向bodipy溶液中加入edc和nhs，搅拌1h后，向其中加入儿茶精适配体溶液，继续反应4h得到适配体修饰的bodipy溶液。

18、其中，步骤(3)中儿茶精适配体为5′-nh2-ttagggttagggttagggttaggg-3′。

19、其中，步骤(3)中儿茶精适配体、bodipy、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比是9-12：9-12：9-12：1-2。

20、作为优选，步骤(3)儿茶精适配体：bodipy：edc：nhs的摩尔比是10：10：10：1。

21、其中，步骤(4)中将步骤(2)得到的多壁碳纳米管分散液加入儿茶精适配体修饰的bodipy溶液中持续振荡1.5-2h，在室温下生成bodipy-mwcnts荧光探针溶液。

22、作为优选，步骤(4)中步骤(2)得到的多壁碳纳米管分散液加入儿茶精适配体修饰的bodipy溶液中持续振荡2h，在室温下生成bodipy-cnts荧光探针溶液。

23、其中，步骤(4)中多壁碳纳米管分散液、儿茶精适配体修饰的bodipy溶液的体积比是8-10：10-11，浓度比为50-55：1。

24、作为优选，步骤(4)中多壁碳纳米管分散液：儿茶精适配体修饰的bodipy溶液的体积比是9：10，浓度比优选为54：1。

25、本发明所述的制备方法所制备的用于检测儿茶精的适配体修饰的bodipy-mwcnts的“关-开”荧光探针。

26、本发明所述的荧光探针在儿茶精定量检测中的应用。

27、本发明首次将bodipy和mwcnts联合用于荧光探针的制备，且首次用于儿茶精检测。本发明制备了具有良好乙醇溶解性的bodipy，mwcnts作为荧光猝灭剂，制成“关-开”探针，确保检测的准确性和特异性。在bodipy上接上儿茶精结合单链dna，使其能与儿茶精特异性结合并引起荧光强度和颜色的变化从而实现儿茶精的准确定量，有效解决儿茶精检测中选择性差。此外，本发明制备的是“关-开”型探针，由于特异性吸附，可以提供准确的结果，且在检测上不受限制。本发明不仅具有重要的基础科学研究价值，而且在食品分析及监测等方面均具有重要的意义。

28、由于bodipy外围有许多反应位点，为进一步功能化所需的各个方面提供了一个多功能平台，现有技术会在其反应位点功能化合成所需要的分子，利用其优越的荧光特性进行物质测定和荧光成像。而本发明侧重点为适配体探针，利用适配体进行识别来促使荧光的变化，而现有技术中的bodipy探针多是利用bodipy分子本身去和目标物反应促使分子结构改变，荧光强度发生改变；且本发明中mwcnts作为猝灭剂，猝灭bodipy的荧光，在有目标物的情况下，荧光恢复，相对于单独的荧光增强探针，荧光的“关-开”可以消除背景干扰，bodipy和mwcnts联合，可以实现更佳的检测效果。本发明制备的适配体修饰的bodipy-mwcnts的“关-开”荧光探针可以用于检测儿茶精，实现儿茶精特异性、快速荧光检测。各种荧光基团支架中，bodipy具有相对较高的摩尔吸收系数、高荧光量子产率和高强度发射峰。碳纳米管(cnts)由于其独特的结构、机械和光电特性而在生物学研究中得到了广泛的应用，特别是碳纳米管的高比表面积和优异的生物相容性，可以为药物递送、生物标志物检测、电化学生物传感等各种生物应用提供合适且有前景的平台。同时碳纳米管是一种具有远程纳米级能量转移特性的荧光猝灭剂，可以有效地对bodipy的荧光进行猝灭。因此，构建了“关-开”型探针，荧光增强的信号变化更易有效检测，而且探针自身的荧光弱，可以降低背景信号，提高探针的灵敏度。本发明中儿茶精适配体与bodipy通过氨基和羧基反应结合从而用于儿茶精的特异性识别。本发明中使用的儿茶精适配体能与儿茶精特异性结合，探针能通过儿茶精适配体与儿茶精结合从而进行特异性识别，由于儿茶精的存在会使猝灭的探针脱离mwcnts恢复bodipy的荧光，所以当儿茶精加入到探针溶液时会引起荧光探针的荧光强度发生变化。随着儿茶精浓度的增加，探针的荧光在紫外灯下会随着儿茶精浓度的增加呈现向强烈的绿色荧光的转变。根据儿茶精浓度与荧光强度之比的线性关系，从而实现儿茶精特异性、高灵敏、快速荧光定量检测。结果表明，此荧光探针检测儿茶精的线性范围为0.1μg/ml-500μg/ml，检测时间约10-20min完成。通过对葛根素、人参皂苷、芸香叶苷等儿茶精结构类似物的分析，以及可能存在的干扰分析物如k+，na+，果糖，丁香酚，木糖醇，d-山梨醇，β-谷淄醇的测定，这些物质均不干扰儿茶精的检测，具有较高的特异性。本荧光探针不需要复杂的合成步骤，不需要苛刻的合成条件，且荧光稳定利于长期保存，检测时间短(10min)，同时本发明的荧光探针制备原料易得、工艺简单、成本低。

29、本发明利用bodipy标记的适体作为识别元件和信号探针开发了一种荧光适体传感器来检测儿茶精，其中多壁碳纳米管作为荧光猝灭剂，通过bodipy上的羧基与儿茶精适配体上的氨基之间的反应，制备bodipy标记儿茶精适配体。当bodipy-适配体加入到mwcnts中时，它们通过π-π共轭作用叠加，导致bodipy-适配体的荧光猝灭。在“关闭”状态下，bodipy-适配体靠近mwcnts，由于bodipy和mwcnts之间的光诱导电子转移(pet)过程，导致了明显的荧光猝灭。在目标儿茶精存在的情况下，根据儿茶精适配体与儿茶精的特异性亲和力，bodipy-适配体可以特异性识别儿茶精并形成复合物。bodipy-适配体的构象变化成功地从mwcnts中分离出来，并实现了bodipy-适配体的荧光恢复(“on”)。通过监测配体传感器荧光强度的增加，高特异性地检测儿茶精。

30、本发明的探针制备中使用了特定的适配体，为了实现适配体与bodipy的成功修饰，在其5’端修饰氨基，与bodipy上的羧基进行酰胺反应。适配体的加入量是根据bodipy的浓度进行优化。通过实验设计的荧光“关开”过程可显著降低自发荧光背景干扰，且利用荧光物质标记核酸适配体是一种高效、低成本的识别高亲和力靶标的策略，易于根据荧光信号的变化进行修饰，故可以实现对儿茶精的灵敏选择。

31、本发明探针制备过程中利用bodipy的上特有的羧基结构，5’端带有的氨基的适配体通过酰胺反应，制成了适配体修饰的bodipy，再利mwcnts的猝灭剂特性，猝灭适配体修饰的bodipy的荧光，最后通过适配体与目标物儿茶精的特异性识别，实现荧光恢复，通过探针的“关-开”过程实现儿茶精的定量检测。

32、此外，本发明的探针中mwcnts作为一个高效的荧光淬灭剂，而bodipy-适配体作为信号指示器和识别分子。当bodipy-适配体被吸附至到mwcnts上时，它们通过π-π共轭叠加，导致荧光淬灭。在目标儿茶精的存在下，bodipy-适配体可以根据和儿茶精之间的特定亲和力，特异性地识别儿茶精，形成一个复合物。bodipy-适配体的构象变化成功地与mwcnts分离，并实现了的荧光恢复。通过监测诱导剂的荧光强度增加，可以高度特异性地检测儿茶精。而只采用bodipy和mwcnts时并不能实现对儿茶精的特异性识别。

33、本发明制备过程中适配体的选择和序列两端的修饰十分重要，其决定是否能够实现荧光物质标记的核酸适配体的制备和目标物的特异性选择；同时bodipy和适配体的成功修饰，需要考虑酰胺化过程需要两种试剂加入的edc和nhs两种试剂的浓度，由于nhs对bodipy的荧光会有比较大的影响，所以需要控制加入的含量，保证本发明不仅可以成功制备探针，并且探针具有优异的荧光性能。

34、除了适配体的对比，在干扰物实验部分，也对本次检测物类黄酮物质儿茶精除外的其他黄酮物质进行了测定，对他类黄酮物质探针并没有响应。

35、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

36、1、本发明制备的适配体修饰的bodipy-mwcnts的“关-开”荧光探针的制备方法，制备工艺简单、原料易得、成本低。

37、2、本发明制备的用于检测儿茶精的适配体修饰的bodipy-mwcnts的“关-开”荧光探针选择性好，灵敏度高，检测速度快，仅对儿茶精有荧光响应，对其他结构类似物包括葛根素、人参皂苷、芸香叶苷均无反应，另外对实际样品中可能存在k+，na+，果糖，丁香酚，木糖醇，d-山梨醇，β-谷淄醇均无反应，具有很好的选择性和特异性，检测方法简单快速。

38、3、本发明制备的适配体修饰的bodipy-mwcnts的“关-开”荧光探针上修饰了黄酮类结合单链dna使其能在复杂的介质中特异性捕获儿茶精并产生荧光信号的变化，该荧光探针对0.1μg/ml-500μg/ml的儿茶精有线性响应，检出限为4ng/ml，性能优异。

39、4、本发明的适配体修饰的bodipy-mwcnts的“关-开”荧光探针对儿茶精的浓度响应为荧光“开启”响应，即随着儿茶精的浓度升高，荧光探针的荧光强度逐渐升高，效果明显。

40、5、本发明为其进一步应用提供了可能，通过单链dna特异性识别的修饰可以有效提高探针检测儿茶精的特异性。

41、6、采用本发明制备的适配体修饰的bodipy-mwcnts的“关-开”荧光探针可有效定量检测儿茶精残留，并且更加便捷高效、节约成本，对控制食品安全、保护人体健康具有重要的意义。