一种干式三电极电化学发光侧向流免疫传感器及其检测应用

本发明涉及微流控芯片，更具体地说，它涉及一种干式三电极电化学发光侧向流免疫传感器及其检测应用。

背景技术：

1、随着ecl检测技术的发展，激发反应所使用的电极由最初的双电极体系扩展至三电极体系。相较于传统的双电极体系，三电极体系由于其所需驱动电压小，反应过程中电极电位稳定，已在电化学及ecl领域成功应用，并成为研究热点

2、传统三电极体系包括工作电极、参比电极和对电极。向工作电极上施加驱动电压时，电流流经工作电极与对电极，工作电极与参比电极作为反馈回路，其间无电流通过，存在电势差，该电势差为定值，以确保反应过程中工作电极上的电位保持恒定，避免了由于反应进行而带来的压降，使工作电极与对电极形成的回路中的电流更加稳定。

3、ecl作为一种新兴的检测手段，由于其操作简单、背景信号低、无需使用同位素、可实现高通量检测等优点，逐渐成为多种标志物的检测手段。将三电极体系与ecl结合的微流控三电极ecl生物传感器具有良好的分析性能，目前已成功应用于基因、金属离子、蛋白酶、细胞等标志物检测，但仍然面临一些问题。例如，传感器内部芯片所使用的电极材料多为银/氯化银、金、铂、铂碳等昂贵材料；芯片加工设备昂贵；芯片修饰过程复杂；传统三电极ecl仅包含一个反应池，难以实现免疫检测所需的侧向流。这些都极大地限制了三电极系统在侧向流免疫检测领域中的应用。

4、干式化学分析技术是一种以干化学分析技术为基础的分析检测技术。相较于湿式化学，干式化学可将所需的反应物预先干化在反应区域内，简化了检测过程。目前，基于侧向流与抗原抗体特异性结合的免疫层析技术而发展的免疫试剂干片，利用荧光标记、金纳米粒子标记等，已实现对多种生物标志物检测。这类免疫试剂干片具有价格低廉、使用简便、检测快速或无需昂贵仪器等优点，克服了传统湿式ecl微流控生物传感器的一些缺陷，但它们要么难于定量检测、要么难于高通量检测或者需要较为昂贵的检测器。因此，它们很难满足集定量、廉价、高通量检测于一体的免疫检测需求。

5、综上，具有定量、廉价、快速、简便，适用于多场景即时检测，能克服传统三电极体系难以实现干式免疫检测的微流控生物传感器已成为该领域技术人员亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是针对现有技术的上述不足，本发明的目的一是提供一种干式三电极电化学发光侧向流免疫传感器。

2、本发明的目的二是提供一种干式三电极电化学发光侧向流免疫传感器的检测应用。

3、为了实现上述目的一，本发明提供一种干式三电极电化学发光侧向流免疫传感器，包括检测芯片，所述检测芯片包括加样垫、结合垫、至少一个检测垫、质控垫、吸收垫、电极垫、底板；所述电极垫的顶部设有共用工作电极，所述共用工作电极两侧的电极垫分别设有对电极、参比电极，所述共用工作电极、对电极、参比电极同方向的一端均作为电接触区，所述对电极的另一端依次设有与所述检测垫数量相等且一一对应的检测区对电极以及一个质控区对电极，相应的，所述参比电极的另一端依次设有与所述检测垫数量相等且一一对应的检测区参比电极以及一个质控区参比电极，所述检测区对电极、质控区对电极、检测区参比电极、质控区参比电极均朝向所述共用工作电极；所述加样垫设有加样垫亲水区，所述结合垫设有结合垫亲水区，所述检测垫设有检测垫亲水区，所述质控垫设有质控垫亲水区，所述吸收垫设有吸收垫亲水区，所述加样垫、结合垫、各个检测垫、质控垫、吸收垫依次排列设于所述电极垫的顶部，所述加样垫亲水区依次连通结合垫亲水区、各个检测垫亲水区、质控垫亲水区、吸收垫亲水区形成单一流路，各个所述检测垫亲水区分别位于对应的检测区对电极、检测区参比电极的正上方，所述质控垫亲水区位于质控区对电极、质控区参比电极的正上方。

4、作为进一步地改进，所述电极垫以疏水性纤维材料为基底，并通过导电材料丝网印刷制成，所述加样垫、结合垫、检测垫、质控垫、吸收垫均以亲水性纤维材料为基底，并通过丝网印刷疏水油墨在基底上形成疏水区与亲水区。

5、进一步地，所述电极垫粘接在所述底板的顶部，所述加样垫、结合垫、检测垫、质控垫、吸收垫的中部均与电极垫紧贴，所述加样垫、结合垫、检测垫、质控垫、吸收垫的两端均与底板粘接。

6、进一步地，所述加样垫与结合垫之间、结合垫与检测垫之间、检测垫与质控垫之间、质控垫与吸收垫之间均设有重合区。

7、进一步地，还包括上盖、下盖，所述下盖内设有用于安装所述检测芯片的安装槽，所述上盖覆盖所述检测芯片，所述上盖分别设有与所述加样垫亲水区对齐的加样孔、与各所述检测垫亲水区一一对齐的检测区观察窗、与所述质控垫亲水区对齐的质控区观察窗、与所述电接触区对齐的开口槽。

8、进一步地，所述加样垫亲水区、吸收垫亲水区均采用吐温处理；所述结合垫亲水区采用吐温处理后，进行干化标记抗体。

9、进一步地，所述检测垫亲水区固定修饰生物标志物包被抗体。

10、进一步地，所述质控垫亲水区固定修饰质控包被抗体。

11、进一步地，所述检测垫亲水区、质控垫亲水区使用壳聚糖与戊二醛进行固定修饰。

12、为了实现上述目的二，本发明提供一种干式三电极电化学发光侧向流免疫传感器的检测应用，包括如下步骤：

13、s1、向传感器的加样垫亲水区滴加含有生物标志物的待测样品溶液，待测样品溶液由加样垫亲水区流经结合垫亲水区，其中生物标志物与干化在结合垫亲水区的标记抗体特异性结合形成“标记抗体-生物标志物”复合物；该复合物进一步流经各个检测垫亲水区，与固定在检测垫亲水区的生物标志物包被抗体结合，形成“标记抗体-生物标志物-包被抗体”免疫三明治夹心型复合物；

14、s2、在生物标志物免疫反应结束后，向加样垫亲水区滴加缓冲液，去除检测垫亲水区未结合的标记抗体；

15、s3、启动ecl分析仪，将传感器放置在ecl分析仪的进出模块上，进出模块将传感器运送到成像检测模块正下方，并将电极垫的电接触区与ecl分析仪的恒电位模块连通；

16、s4、启动ecl分析仪上的检测按钮，通过ecl分析仪的恒电位模块提供驱动电压，触发标记抗体分子内反应，产生ecl信号，由ecl分析仪自动采集和分析ecl信号，进而根据ecl信号的强度对生物标志物进行定量检测。

17、有益效果

18、本发明与现有技术相比，具有的优点为：

19、1、本发明巧妙地使用亲水无纺布与疏水电极垫，通过层叠结构使每层垫片可分别进行修饰，避免了传统干片对电极的直接修饰和各区域互相污染的问题，结合了侧向流，创造性地实现了三电极ecl免疫检测。

20、2、本发明根据加样垫、结合垫、检测垫、质控垫与吸收垫亲水区域的设计，电极仅在芯片各层层叠后且待测样品溶液充满流路时才会使电流形成两条并联回路，提高了芯片触发反应的可控性。

21、3、本发明的工作电极与分析仪的恒电位模块连通后，检测回路与质控回路在使用同一工作电极的前提下，拥有不同的电位和反馈信号，避免了检测区与质控区之间相互干扰，使检测区与质控区分别独立进行ecl反应。

22、4、本发明所提出的一种干式三电极ecl侧向流免疫传感器使用串联流路，使传感器仅需一次加样与冲洗，即可实现免疫检测，克服了传统三电极在进行湿式免疫检测时，需要多次加样、冲洗的问题。

23、5、本发明首次将干式三电极ecl侧向流技术应用于免疫检测，该技术具有良好的灵敏度与动态范围，满足超敏检测的要求，相较于常规的湿式免疫检测，本发明检测技术成本低，操作便捷，检测时间短。

24、6、本发明使用钌的复合物，将聚赖氨酸与钌结合，使其成为分子内共反应剂，相较于传统钌探针，无需额外添加共反应剂，ecl信号强度大大提升，从而提高了生物标志物的检测限，扩大了动态检测范围。

25、7、本发明所检测的生物标志物可根据需求，通过标记抗体的改变而进行替换，实现多种生物标志物的超敏与定量检测，大大增加了传感器的适用范围。

26、8、本发明的传感器的检测区与质控区共用工作电极，通过简单的延长工作电极，对电极与参比电极，无需增加电极总数，即可实现三电极体系下多元免疫检测与质控。

27、9、本发明的传感器所使用的无纺布由天然木浆与人造纤维结合而成，具有韧性足，流动性好、透光率高，便于ecl信号由电极穿过检测垫与质控垫等优点。

28、10、本发明使用无纺布，极大地降低了传感器的制造成本，简化了传感器的加工过程。这很好地满足了芯片制造加工、试剂干化、溶液流动和信号释放的需求。

29、11、本发明的传感器使用过程简便，无需专业人员操作，有利于在基层医疗单位或家庭进行使用，具有多场景应用的价值。