用于检测人体的液体标本中肿瘤细胞的试剂盒

本发明涉及肿瘤细胞的检验检测领域，具体涉及一种用于检测人体的液体标本中肿瘤细胞的试剂盒。

背景技术：

1、人体的液体标本包括胸水、尿液、腹水、血液等液体形态的标本。在一些病理情况下如感染、恶性肿瘤等，人体的某些体腔会产生过多的体液而发生积液，如胸膜腔、腹腔等。如何快速、有效、准确地判断这些体液标本是否是恶性肿瘤引起的，具有十分重要的临床意义。而明确其是否是恶性肿瘤积液的金标准是在体液标本中找到恶性肿瘤细胞。以胸水为例，胸膜腔正常情况下只有少量润滑液，病理下会产生大量液体造成积液。目前诊断胸水是否是恶性的方法为：收集胸水标本，离心后取细胞沉淀，固定包埋成石蜡块保存，切片染色在显微镜下找恶性肿瘤细胞。此方法步骤过多，耗时长(3-7天)，对数量极少的肿瘤细胞容易漏诊。另外，检查尿液脱落细胞中是否包含肿瘤细胞的过程与对胸水标本的检查类似。

2、专利申请cn201610878477公开一种循环肿瘤细胞快速检测试剂盒及其制备和应用方法。该试剂盒联合免疫捕获和膜过滤的方法分离循环肿瘤细胞。所述试剂盒包括循环肿瘤细胞吸附剂、肿瘤细胞荧光纳米探针、白细胞荧光纳米探针；所述循环肿瘤细胞吸附剂中肿瘤细胞表面特异性抗体选自：epcam或egfr；所述白细胞荧光纳米探针中白细胞特异性抗体选自：cd45、cd15或cd33；所述肿瘤细胞荧光纳米探针中肿瘤细胞特异性抗体选自：ck8/ck18/ck19、panck、vimentin或plastin-3；该试剂盒具有操作便捷、检测时间短、快速准确、无需大型仪器、可降低癌症筛查成本、易被患者接受等特点，可产生良好的经济和社会效益。但该循环肿瘤细胞一般来自于血液，而事实上因血液中各种干扰因素的影响，直接对过滤膜上截留的肿瘤细胞进行检验是有相当大的难度的。而且该专利申请中也没有公开任何肿瘤细胞已经过滤和检测成功的镜检照片。也就是说，虽然现有技术中已经公开使用过滤膜过滤血液中癌细胞然后镜检的方法，但因为其中具体操作方法和细节的限制，而使得这样的试剂盒很难得到商用。

3、因此，本领域需要提供一种新的用于检测人体的液体标本中肿瘤细胞的检测试剂盒。

技术实现思路

1、我们开发了一种基于膜过滤技术快速富集肿瘤细胞的方法用于快速分离富集诊断液体标本中的肿瘤细胞。其原理为通过膜过滤技术直接分离液体标本中的细胞，其中红细胞和白细胞被去除，上皮细胞、间皮细胞和肿瘤细胞等体积较大的细胞被牢固的吸附固定在过滤膜上。整个过滤过程一步完成，无需前期处理步骤，过滤完成后过滤膜可以进行各种下游染色(如he染色即苏木精—伊红染色，巴氏染色，免疫组化染色)。

2、因此，本发明首先提供一种用于检测人体的尿液标本中肿瘤细胞的试剂盒，所述试剂盒包括过滤膜、细胞固定物和常规染色用的染料，所述过滤膜的滤孔为穿透膜厚度方向的直孔道，且滤孔的孔径为5～20微米，过滤膜的厚度为30微米以下，所述细胞固定物中包含甲醛和/或多聚甲醛，所述染料中包含苏木素，所述人体的液体包括胸水、尿液、腹水、血液中的一种或多种。

3、本发明还提供一种用于检测人体的胸水标本中肿瘤细胞的检测试剂盒，所述试剂盒包括过滤膜、细胞固定物和免疫组化用的高碘酸，所述过滤膜的滤孔为穿透膜厚度方向的直孔道，且滤孔的孔径为5～20微米，过滤膜的厚度为30微米以下，所述细胞固定物中包含甲醛和/或多聚甲醛。

4、本发明还提供一种用于检测人体的液体标本中肿瘤细胞的检测试剂盒，所述试剂盒包括过滤膜、细胞固定物、常规染色用的染料和免疫组化用的高碘酸，所述过滤膜的滤孔为穿透膜厚度方向的直孔道，且滤孔的孔径为5～20微米，过滤膜的厚度为30微米以下，所述细胞固定物中包含甲醛和/或多聚甲醛，所述染料中包含苏木素。

5、本发明中，所述过滤膜的直孔道是指膜上的通孔为垂直膜面的垂直孔道或倾斜孔道，该滤孔不是弯曲孔道或无规孔道。

6、在一种具体的实施方式中，所述试剂盒中包含高碘酸溶液，且高碘酸溶液的浓度为0.01～2wt％，优选0.05～1wt％，更优选0.1～0.5wt％。

7、本本发明中，所使用的高碘酸溶液的浓度和加入高碘酸溶液后的室温反应时间关联。在高碘酸溶液浓度为0.2％时反应2分钟最佳。使用本发明所述试剂盒时，高碘酸溶液的浓度太高则可能会影响抗原，导致阳性反应较弱。例如高碘酸溶液浓度为0.5％时反应1分钟，可能可以得到较为满意的检测结果，但也可能会阳性反应稍弱。而若高碘酸溶液浓度为1％或2％时，则检测的阳性反应会更弱。另外，高碘酸溶液浓度较低则需要相应延长反应时间，例如高碘酸溶液浓度为0.1％时，相应需要把反应时间延长至5分钟左右。

8、在一种具体的实施方式中，所述试剂盒中还包含与待测肿瘤细胞匹配的一抗。

9、在一种具体的实施方式中，所述试剂盒中还包含曲拉通x100、二抗以及浓缩的dab染色剂中的一种或多种。

10、在一种具体的实施方式中，所述试剂盒中还包括过滤器，所述过滤器包括过滤柱和用于控制液体流动的阀门。

11、在一种具体的实施方式中，所述过滤膜为径迹蚀刻膜，且所述径迹蚀刻膜的厚度为25微米以下，优选20微米以下，更优选15微米以下。

12、发明中，过滤膜的厚度过厚则容易堵塞孔道。在现有技术中包含规整直孔道且厚度够薄的过滤膜中，径迹蚀刻膜是最合适的，而光刻膜的厚度很难达到这个要求。

13、在一种具体的实施方式中，所述过滤膜为孔径均匀且孔径在7～9微米的径迹蚀刻膜。

14、在一种具体的实施方式中，所述试剂盒还包括用于封片的浓度为20～60wt％的甘油。

15、在一种具体的实施方式中，所述细胞固定物为细胞固定液，且所述细胞固定液为浓度为2.5～20wt％的多聚甲醛溶液或浓度为4～50wt％的甲醛溶液。

16、本发明还提供一种如上所述试剂盒的应用，包括先使用过滤膜过滤体液，再在体液液面降低至仍然保持在过滤膜的膜面上方时加入生理盐水继续过滤，加入生理盐水继续过滤的次数为一次或多次，然后在体液与生理盐水的混合液液面降低至仍然保持在过滤膜的膜面上方时加入呈液态的细胞固定物，将过滤膜上的细胞固定，细胞固定物固定细胞的时间为1分钟以上，优选3～60分钟，更优选5～20分钟，然后将细胞已经固定好的过滤膜从过滤器中取出，再对过滤膜使用免疫组化处理后送镜检；且将另一张已经过滤和细胞已经固定好的过滤膜从过滤器中取出，再对过滤膜使用所述常规染色用的染料染色后送镜检；或者将进行免疫组化处理相同的一张过滤膜裁剪成多份后，对另一份过滤膜使用所述常规染色用的染料染色后送镜检；且所述免疫组化处理包括先在过滤膜上加高碘酸溶液，再先后在过滤膜上孵育一抗和二抗，再对其使用dab染料染色，最后使用甘油封片以便送镜检；优选在固定反应完成后，继续过滤以便将包含细胞固定液、体液和生理盐水的混合液全部流动至过滤膜下方，再从过滤器中取出膜上细胞已经固定好的过滤膜；另外，优选加入高碘酸溶液的反应时间为0.5～10分钟，更优选1～5分钟。

17、优选所述人体的液体即体液包括胸水、尿液、腹水、血液中的一种或多种。

18、本发明至少具备如下有益效果：

19、1、耗时短，检测速度快，可以用于快速病理检测。

20、2、步骤简单，液体样品不需要繁琐的前期预处理。

21、3、可以直接分离掉绝大部分红细胞和白细胞，视野干净，更有利于在显微镜下观察，排除干扰。该分离过程尤其对常规染色法来说非常重要。

22、4、样品处理量大，提高检出率，减少假阴性。

23、5、所有待检测细胞，均匀地分布于一个平面膜上，不需要传统的从石蜡块中切片后显微镜下观察。对于阳性细胞很少的标本可以大大提高检测效率和灵敏度。

24、6、本发明的试剂盒中包含细胞固定物，且细胞固定物中包含甲醛和/或多聚甲醛，且在使用所述试剂盒中的细胞固定物时，具体以浓度为2.5～20wt％的多聚甲醛溶液或浓度为4～50wt％的甲醛溶液为细胞固定液，结合特定的细胞固定方法，即过滤膜上的肿瘤细胞在未被完全固定之前保持不直接与空气接触，即固定前的细胞保持处在液体环境中。这使得本发明所述试剂盒和相应的操作方法能成功固定过滤膜上的肿瘤细胞，用于镜检。

25、7、本发明用于检测胸水标本或用于检测其他体液标本的试剂盒中包含免疫组化用的高碘酸。本发明在使用高碘酸后，后续结合使用一抗、二抗和dab染色剂，使得本发明所述胸水标本或体液标本中的肿瘤细胞的种类能被明确鉴定。高碘酸的使用对本发明试剂盒极为重要，不使用高碘酸处理会造成严重的非特异性染色，出现假阳性结果。本发明提供的试剂盒为肿瘤细胞的鉴定提供了一种非常方便快捷的方式。

26、8、对于本发明所述试剂盒的应用来说，为了保持肿瘤细胞在固定之前处于液体中，发明人之前使用显微镜对过滤膜上的肿瘤细胞进行在线监测，但这毕竟大幅增加了装置设备的复杂程度和操作难度。而本发明中却保持肿瘤细胞处在液体环境时，即在过滤尚未完结之前就将固定液倒入过滤器中，待肿瘤细胞在过滤膜上的液体环境中完全固定后，再将剩余的液体滤掉和将过滤膜取出，使得本发明能高效和精准地检测到标本中的肿瘤细胞。