一种脂质体注射液包封率测定方法与流程

本发明涉及药物有效成分的检测方法，具体涉及脂质体包封率测定的方法。

背景技术：

1、包封率，是指被包裹物质(如某药物)在脂质体悬液中占药物总量的百分量。它是脂质体质量控制的一个重要的指标，反映了药物被载体包封的程度。包封率＝(脂质体中包封的药物/脂质体中药物总量)×100％。脂质体包封率是指被包裹物质(如某药物)在脂质体中的百分量。可利用下式计算出百分包封率：en％＝(1一cf/ct)×100％。其中，cf为游离药物的量，ct为脂质体悬液中药物的总量。

2、一般可以将游离药物与脂质体分离后对包封率进行分析测定，如采用葡聚糖凝胶、超速离心法、透析法等分离方法将溶液中游离药物和脂质体分离，分别测定，计算包封率。通常要求脂质体的药物包封率达80％以上。已经上市的药物盐酸伊立替康脂质体注射液是包封在脂质双层囊泡或脂质体中的拓扑异构酶1抑制剂，适用于转移性胰腺癌，和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)/甲酰四氢叶酸(leucovorin)共同用于治疗曾接受过吉西他滨(gemcitabine)化疗后期晚期(转移性)胰脏癌病患。

3、本发明经过研究，提供一种新的测定脂质体包封率的方法，特别适用于盐酸伊立替康脂质体注射液。

技术实现思路

1、本发明提供一种脂质体注射液包封率测定方法，其特征在于，所述方法，步骤如下：

2、1)空白溶液的配制；

3、2)供试品溶液的配制；包括供试品溶液a的配制；供试品溶液b的配制；供试品溶液c的配制；

4、3)测定：取空白溶液与供试品溶液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图峰面积，计算供试品溶液的包封率；

5、计算方法采用以下公式：

6、(1)包封率：

7、

8、(2)层析柱回收率：

9、

10、式中：a1表示供试品溶液a色谱图中药物的峰面积；a2表示供试品溶液b色谱图中药物峰面积；a3表示供试品溶液c色谱图中药物峰面积。

11、其中，所述高效液相色谱的色谱条件如下：

12、仪器：液相色谱仪，vwd或dad

13、色谱柱：thermo hypersil bds c8(4.6mm×150mm，5μm)

14、流动相：1-己烷磺酸钠溶液：乙腈＝75：25

15、柱温：40℃；流速：1.0ml/min；检测波长255nm；

16、进样量：10μl；运行时间：10min。

17、其中，所述供试品为伊立替康脂质体注射液。

18、根据需要所述供试品也可以是其他脂质体注射液，如盐酸多柔比星脂质体注射液、两性霉素b脂质体注射液、紫杉醇脂质体注射液，布比卡因脂质体注射液等。

19、其中所述空白溶液的配制，方法如下：

20、空白溶液1的配制：取稀释剂，标记为空白溶液1，

21、空白溶液2的配制：精密量取洗脱剂100μl，置层析柱，待完全进入柱床，立即补入洗脱剂0.5ml，当该部分洗脱剂也进入柱床后，加入洗脱剂4.5ml，使之在重力作用下洗脱，收集洗脱液置50ml量瓶中，再加入洗脱剂10ml，最后用稀释剂稀释至刻度，摇匀，标记为空白溶液2，

22、空白溶液3的配制：在完成上一项洗脱的层析柱内精密加入洗脱剂15ml，使之在重力作用下洗脱，收集洗脱液置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，标记为空白溶液3，

23、其中所述层析柱为凝胶层析柱，其制备方法为：取sepharose cl-4b琼脂糖凝胶适量，超声除去气泡，然后缓慢装入层析柱管，装填凝胶高度约8cm，再用洗脱剂约20ml平衡，备用。

24、其中所述供试品溶液的配制，方法如下：

25、供试品溶液a的配制：精密量取供试品100μl，置层析柱，待完全进入柱床，立即补入洗脱剂0.5ml，当该部分洗脱剂也进入柱床后，加入洗脱剂4.5ml，使之在重力作用下洗脱，收集洗脱液置50ml量瓶中，再加入洗脱剂10ml，最后用稀释剂稀释至刻度，摇匀，用0.22μm滤膜过滤，取续滤液适量，为供试品溶液a，

26、供试品溶液b的配制，在完成上一项洗脱的层析柱内精密加入洗脱剂15ml，使之在重力作用下洗脱，收集洗脱液置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，用0.22μm滤膜过滤，取续滤液适量，为供试品溶液b，供试品溶液c的配制：精密量取供试品100μl，置50ml量瓶中，加入洗脱剂15ml，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，用0.22μm滤膜过滤，取续滤液适量，标记为供试品溶液c，

27、其中，洗脱剂配制方法为：称取氯化钠9g，加水适量使溶解并稀释至1000ml，摇匀，稀释剂配制方法为：量取盐酸1ml，加甲醇稀释至1000ml，摇匀。

28、其中所述测定，方法如下：取空白溶液1，2，3与供试品溶液a,b,c各10ul，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图峰面积，计算供试品溶液的包封率；

29、计算方法采用以下公式：

30、(1)包封率：

31、

32、(2)层析柱回收率：

33、

34、式中：a1表示供试品溶液a色谱图中伊立替康峰面积；a2表示供试品溶液b色谱图中伊立替康峰面积；a3表示供试品溶液c色谱图中伊立替康峰面积。

35、最优选的，本发明所述方法，步骤如下：

36、1)空白溶液的配制：

37、空白溶液1的配制：取稀释剂，标记为空白溶液1。

38、空白溶液2的配制：精密量取洗脱剂100μl，置层析柱，待完全进入柱床，立即补入洗脱剂0.5ml，当该部分洗脱剂也进入柱床后，加入洗脱剂4.5ml，使之在重力作用下洗脱，收集洗脱液置50ml量瓶中，再加入洗脱剂10ml，最后用稀释剂稀释至刻度，摇匀，标记为空白溶液2。

39、空白溶液3的配制：在完成上一项洗脱的层析柱内精密加入洗脱剂15ml，使之在重力作用下洗脱，收集洗脱液置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，标记为空白溶液3。

40、其中所述层析柱为凝胶层析柱，其制备方法为：取sepharose cl-4b琼脂糖凝胶适量，超声除去气泡，然后缓慢装入层析柱管，装填凝胶高度约8cm，再用洗脱剂约20ml平衡，备用。

41、2)供试品溶液的配制：

42、供试品溶液a的配制：精密量取供试品100μl，置层析柱，待完全进入柱床，立即补入洗脱剂0.5ml，当该部分洗脱剂也进入柱床后，加入洗脱剂4.5ml，使之在重力作用下洗脱，收集洗脱液置50ml量瓶中，再加入洗脱剂10ml，最后用稀释剂稀释至刻度，摇匀，用0.22μm滤膜过滤，取续滤液适量，为供试品溶液a。

43、供试品溶液b的配制，在完成上一项洗脱的层析柱内精密加入洗脱剂15ml，使之在重力作用下洗脱，收集洗脱液置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，用0.22μm滤膜过滤，取续滤液适量，为供试品溶液b。

44、供试品溶液c的配制：精密量取供试品100μl，置50ml量瓶中，加入洗脱剂15ml，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，用0.22μm滤膜过滤，取续滤液适量，标记为供试品溶液c。

45、其中，洗脱剂配制方法为：称取氯化钠9g，加水适量使溶解并稀释至1000ml，摇匀。稀释剂配制方法为：量取盐酸1ml，加甲醇稀释至1000ml，摇匀。

46、3)测定：取空白溶液1，2，3与供试品溶液a,b,c各10ul，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图峰面积，计算供试品溶液的包封率；

47、计算方法采用以下公式：

48、(1)包封率：

49、

50、(2)层析柱回收率：

51、

52、式中：a1表示供试品溶液a色谱图中伊立替康峰面积；a2表示供试品溶液b色谱图中伊立替康峰面积；a3表示供试品溶液c色谱图中伊立替康峰面积。

53、其中，所述高效液相色谱的色谱条件如下：

54、仪器：液相色谱仪，vwd或dad

55、色谱柱：thermo hypersil bds c8(4.6mm×150mm，5μm)

56、流动相：1-己烷磺酸钠溶液(称取1-己烷磺酸钠2g，加水1000ml使溶解，加三乙胺2ml，混匀，用磷酸调节ph值至2.5)：乙腈＝75：25

57、柱温：40℃；流速：1.0ml/min；检测波长255nm；

58、进样量：10μl；运行时间：10min。

59、其中，所述供试品为伊立替康脂质体注射液。

60、本发明的色谱条件(流动相比例的选择)是经过筛选得到的，筛选过程如下：

61、分别考察不同流动相比例(10％乙腈、25％乙腈、50％乙腈)对色谱峰的影响。实验结果显示流动相10％乙腈不出峰，而50％乙腈出峰时间太早，与溶剂法无法达到完全分离，且峰形不好；25％乙腈峰形很好，与溶剂峰分离较好，故可以选择15％乙腈。

62、本检测方法与现有类似方法的差异，如申请号cn201110263566中，采用高效液相色谱与分子排阻色谱相结合来测定脂质体药物的包封率，特别适用于包封疏水疏脂性药物的纳米脂质体制剂，但其制备和检测过程复杂，将高分子排阻硅胶柱与hplc相连接，且测试过程中要更换流动相。本发明采用凝胶色谱法将包封和游离的成分进行简单的完全分离，且测定时采用hplc法，无需中途更换流动相，高效便捷。

63、本发明的优点在于：

64、1.本发明样品提取方法简单高效；

65、2.本发明检测时间短，检查效率高。