一种用于双参数检测的荧光传感器的构建方法及应用

本发明属于传感器领域，涉及双参数检测模式的探索，特别是指一种用于双参数检测的荧光传感器的构建方法及应用。

背景技术：

1、目前，实现多参数同时检测的方法主要有有电化学法、比色法和荧光法。在电化学方法中，固定在电极表面的dna探针会和待检测的物质相互作用，并诱导dna结构和电化学性质发生变化，从而产生电信号来检测待测物。多参数检测时，传统方法是在核酸适体链上标记二茂铁或亚甲基蓝，通过氧化还原电位值的不同实现对不同目标物的检测，例如zhengy,liang w,yuan y,et al.wavelength-resolved simultaneous photoelectrochemicalbifunctional sensor on single interface:a newly in vitro approach formultiplexed dna monitoring in cancer cells[j].biosensors and bioelectronics。电化学传感器虽具有灵敏度高、选择性好、检出限低等优点，但其电极制备过程繁琐；比色法通常是通过观测一些dna过氧化物酶催化小分子产生的颜色变化或是不同分散状态下金属纳米棒的颜色差异来获得信号的。多参数检测时，加入不同待测物会产生不同颜色，通过颜色的变化来确定待测物类型。比色传感器构建成本较低、操作简单、实用性强，但在检测的精度方面有所欠缺，而患者在早期诊断时疾病标志物基因含量通常只有痕量；荧光法是依靠荧光信号为检测手段，常见荧光信号分子主要包括修饰在dna分子上的荧光基团，金银铜纳米簇等。除此之外，g-四链体还能与一些卟啉类的分子，如n-甲基卟啉二丙酸ix、硫磺素t等特异性结合发出荧光。多参数检测时，通过在dna链标记或特异性结合具有不同荧光发射的荧光染料实现检测。荧光传感器有稳定性好、灵敏度高、操作简单、使用寿命长等优点，在实际生活中应用广泛，具有广阔的应用前景。

2、为开发一种操作简单、普适性强、响应速度快的用于双参数同时检测的生物传感器方法。

技术实现思路

1、本发明提出一种用于双参数检测的荧光传感器的构建方法及应用，用于荧光信号分子硫磺素t和fam(6-羧基荧光素)的发光特性，通过分子发夹构型变化，实现荧光转换，建立了用于两种疾病标志物基因同时检测的荧光传感器，并对其普适性做了相关研究。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、用于双参数检测的荧光传感器的构建方法，步骤为：

4、(1)配制含有发夹探针hp1和发夹探针hp2的tris-hcl缓冲液，经避光静置激活，作为储备液；

5、(2)向储备液中加入缓冲液，再加入tht溶液，室温培养即得荧光传感器的工作溶液。

6、上述步骤(1)中发夹探针hp1为有标记荧光探针，发夹探针hp2为无标记荧光探针。

7、上述发夹探针hp1的3’端与-bhq1相连、5’端与fam-相连。

8、上述发夹探针hp1为hp(brca2)、hp(dna19)、hp(k-ras)、hp(p53-1)和hp(dna36)中的任意一个；其中hp(brca2)序列如seq id no.2所示、hp(dna19)序列如seq id no.3所示、hp(k-ras)序列如seq id no.4所示、hp(p53-1)序列如seq id no.5所示、hp(dna36)序列如seq id no.6所示；发夹探针hp2为hp(ad)、hp(p53-2)、hp(pten)和hp(hbv)中的任意一个；其中hp(ad)序列如seq id no.1所示、hp(p53-2)序列如seq id no.7所示、hp(pten)序列如seq id no.8所示、hp(hbv)序列如seq id no.9所示。

9、上述tris-hcl缓冲液的浓度为20mmol/l、ph为7.0；储备液中发夹探针hp1和发夹探针hp2的浓度均为5μmol/l。

10、上述步骤(2)中缓冲液为20mm tris-hcl、300mm kcl，ph＝9；tht溶液的浓度为2100μmol/l。

11、上述储备液、缓冲液与tht溶液的体积比为1:46:0.5；室温培养的时间为5min。

12、上述的构建方法制备的荧光传感器。

13、上述的荧光传感器在非疾病诊断为目的的同时检测多种目标物中的应用，步骤为：向588μl荧光传感器的工作溶液中加入待测溶液，37℃恒温摇床孵育60min，利用荧光分光光度计检测加入待测溶液前后的荧光值f和f0，计算荧光强度的变化值f-f0，代入线性方程计算目标物的浓度；其中荧光分光光度计的激发波长设置为460nm，发射波长为465～650nm，激发狭缝为2.5nm，发射狭缝为5.0nm。

14、上述目标物为ad和brca2时线性方程为y＝3.9897x-6.5337，r12＝0.9886，y＝4.0938x+0.3458，r22＝0.9939，检出限分别为0.53和0.36nmol/l；目标物为ad和dna19时线性方程为y＝3.3290x-0.8471，r12＝0.9966，y＝4.3307x+2.8466，r22＝0.9914，检出限分别为0.67和0.34nmol/l；目标物为ad和k-ras时线性方程为y＝3.0940x-6.5998，r12＝0.9795，y＝4.1836x+12.1746，r22＝0.9744，检出限分别为0.72和0.31nmol/l；目标物为ad和p53-1时线性方程为y＝3.1007x-4.2411，r12＝0.9966，y＝4.4243x+0.1620，r22＝0.9996，检出限分别为0.81和0.37nmol/l；目标物为ad和dna36时线性方程为y＝2.9428x-3.7615，r12＝0.9981，y＝3.0487x+0.6233，r22＝0.9997，检出限分别为0.83和0.63nmol/l，目标物为p53-2和p53-1时线性方程为y＝3.270x-0.715，r12＝0.993，y＝3.562x+18.558，r22＝0.986，检出限分别为0.63和0.99nmol/l；目标物为pten和p53-1时线性方程为y＝3.306x+28.879，r12＝0.988，y＝3.788x-6.956，r22＝0.999，检出限分别为0.54和1.06nmol/l；目标物为hbv和p53-1时线性方程为y＝3.482x+10.104，r12＝0.988，y＝2.708x+2.364，r22＝0.999，检出限分别为1.26和1.19nmol/l。

15、本技术的双参数检测的荧光传感器的检测机理为：通过设计两种发夹探针，发夹探针hp1环部为与靶dna互补配对的碱基序列，5′端为富g序列，3′端与部分富g序列互补配对形成发夹茎部；另一种发夹探hp2环部为与靶dna互补配对的碱基序列或识别目标物的核酸适体链，5′端标记荧光基团fam，3′端标记淬灭基团bhq1，两种发夹探针都是单独锁定的，设置同一激发波长，在没有目标物的情况下，hp1和hp2均为发夹结构，hp1中富g序列大部分被锁在茎中，无法与tht结合，荧光强度较低，hp2中fam与bhq1的距离极为接近时，发生荧光共振能量转移，其荧光信号被抑制，因此hp1和hp2均表现出微弱的荧光；加入靶目标1后，靶dna与hp1环部互补配对结合，分子发夹被打开，茎部富g序列被释放，在k+诱导下形成g-四链体结构，与tht结合在487nm处产生强荧光信号。此时hp2为发夹结构，因此在514nm处不产生荧光信号；加入靶目标2后，hp1不发生反应，在487nm处为低荧光信号。hp2发夹打开，荧光基团远离淬灭基团，在514nm处产生灵敏的荧光信号；同时加入靶目标1和靶目标2后，hp1和hp2发夹探针均打开，在487nm和514nm处均产生灵敏的荧光信号。因此可以通过加入靶标前后荧光值的变化实现对双参数的同时检测。

16、本发明具有以下有益效果：

17、本技术的用于双参数同时检测的荧光传感检测方法。在优化条件下，分别以(pten、ad、hbv、p53-2)为目标1，以5种不同碱基长度的dna序列(brca2、dna19、k-ras、p53、dna36)为目标2，结果表明在更换不同目标1与目标2后，传感器能均能实现准确测量，证明此方法具有实验设计简单、操作方便且普适性强，单次激发即可实现双目标的同时检测，为多种疾病标志物基因同时检测提供了一种简单且普适的方法，同时此传感器也可以应用于检测核酸序列以外的生物分子，只需在原有传感器中加入目标2生物分子的核酸适体互补序列即可，为双参数传感器实际应用提供了基础。

18、标记型荧光传感器应用广泛、灵敏度高，但多参数同时检测时需要进行多次标记，过程繁琐，价格昂贵；无标记荧光传感器去除了繁琐的标记过程但进行多目标检测时多使用贵金属纳米团簇，具有性能不稳定的缺点，而且不同染料之间存在互相干扰。本技术的用于双参数同时检测的荧光传感方法结合标记型和无标记型传感器优点，在实现双参数检测的同时保证了传感器的稳定性，避免了及双参数互相之间的干扰。