一种伍尔夫型苯硼酸功能化磁珠及其制备方法和应用

本发明涉及生物，尤其涉及一种伍尔夫型苯硼酸功能化磁珠的制备方法及其应用。

背景技术：

1、病原微生物又称病原体，其体形微小，结构简单，主要包括致病菌、病毒、真菌和支原体等。据报道在1980-2014年间，美国有超过四百万人死于由病原微生物引起的各种传染病。在众多病原微生物导致的危害中，由致病菌所导致的危害具有范围广、速度快等特点，其可以通过各种方式，如接触、消化道、呼吸道、昆虫叮咬等在正常人群间传播疾病，具有较强的传染性，对公共卫生构成严重威胁。最常见的细菌源性疾病是食源性疾病、尿路感染、性传播感染和医疗相关感染。因此，对致病菌进行快速筛查和风险防控是食品安全、环境评估和临床诊断的刚性需求。

技术实现思路

1、基于此，本发明的目的在于提供一种伍尔夫型苯硼酸功能化磁珠的制备方法及其应用，该方法可以在低梯度磁场下从复杂基质中快速分离细菌，捕获效率高、操作简便、分离时间短。

2、为了解决本发明的上述技术问题，本发明提供采用以下技术方案：

3、本发明的第一目的是提供一种伍尔夫型苯硼酸功能化磁珠的制备方法，包括如下步骤：

4、1)将纳米磁珠洗涤、重悬，得到纳米磁珠溶液；

5、2)分别将edc(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)和nhss(n-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐)溶解于无菌pbs溶液，得到edc溶液及nhss溶液，然后加入到步骤1)所得纳米磁珠溶液中，室温条件下活化1-2h，将活化后的纳米磁珠再次洗涤、重悬，得到活化后的纳米磁珠溶液；

6、3)将3-氨基苯硼酸和1,6-己二胺溶于四氢呋喃溶液中，在磁力搅拌器上于40℃反应1-2h，得到伍尔夫型苯硼酸溶液；

7、4)将步骤3)所得伍尔夫型苯硼酸溶液加入至步骤2)所得活化后的纳米磁珠溶液中，反应3-5h，所得反应产物经洗涤、重悬后，得到伍尔夫型苯硼酸功能化磁珠。

8、进一步，步骤1)中，所述纳米磁珠的粒径为160-200nm。

9、进一步，步骤2)中，edc和nhss的质量比为2.90:3.26。

10、进一步，所述洗涤、重悬均采用无菌pbs溶液。

11、进一步，所述无菌pbs溶液的浓度为0.01m，ph为7.4。

12、本发明的第二目的是提供上述制备方法制得的伍尔夫型苯硼酸功能化磁珠。

13、本发明的第三目的是提供上述伍尔夫型苯硼酸功能化磁珠在细菌分离中的应用。

14、进一步，伍尔夫型苯硼酸功能化磁珠加入含细菌的样本溶液中，在37℃条件下，以100-300rpm，混匀孵育10-40min，然后插入磁力架分离4-5min，分离产物洗涤后重悬得到细菌-伍尔夫型苯硼酸-纳米磁珠复合物。

15、进一步，所述细菌为革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌。

16、本发明采用的伍尔夫型苯硼酸含有氨基官能团，可通过氨基与纳米磁珠表面的羧基相连，利用伍尔夫型苯硼酸的硼酸亲和作用与细菌表面的顺氏二醇结构(如革兰氏阳性菌的磷壁酸、革兰氏阴性菌的l-阿洛酮糖)相连，从而达到富集分离细菌的目的。

17、本发明的有益效果：

18、1、本发明先通过edc和nhss将纳米磁珠表面的羧基活化，然后再利用活化后的羧基与伍尔夫型苯硼酸上的氨基进行共价结合，将伍尔夫型苯硼酸偶联到纳米磁珠表面，得到伍尔夫型苯硼酸功能化磁珠。相比于牛血清蛋白或者聚乙二醇介导偶联的方法，本发明的伍尔夫型苯硼酸功能化磁珠制备方法更为简单，耗时更短且成本更低。

19、2、本发明制备所得的伍尔夫型苯硼酸功能化磁珠与细菌表面的顺氏二醇结构具有较强的亲和力，相比于抗体，具有稳定性好、成本低、质量可控等优点，相比于普通的苯硼酸，伍尔夫型硼酸含有与硼酸相邻的胺，由于b和n原子之间的分子内相互作用，具有较低的pka值，这使得硼酯在中性和碱性条件下都是稳定的且与顺氏二醇结构的亲和力更强。基于上述优点，在单次分离过程中，本发明构建的伍尔夫型苯硼酸功能化磁珠在成本上较免疫磁分离成本大大降低；在材料保质期方面较免疫磁珠更长。

20、3、细菌感染往往是多种致病菌共存的情况。本发明采用的伍尔夫型苯硼酸功能化磁珠属于广谱性识别细菌的分子识别剂，用于分离基质中的细菌，是一种通用的分离策略，可以将基质中的大多数细菌都分离出来，然后通过聚合酶链式反应(pcr)或传统培养法进行鉴别。相比之下，抗体因其只能专一的识别，从而分离出对应的目标菌，其他存在于基质中的致病菌无法鉴别，不适用于快速筛查大量未知目标菌的可疑样本。

21、4、本发明将伍尔夫型苯硼酸修饰于纳米磁珠表面，相比于替考拉宁修饰的纳米磁珠只能分离革兰氏阳性菌的方法，本发明中使用的伍尔夫型苯硼酸能够识别更多的细菌，因为伍尔夫型苯硼酸的靶点是细菌上含有丰富的顺氏二醇结构的糖蛋白，故而其广谱性更强，能够分离的细菌种类更多，且具有较高的分离效率。

22、5、本发明制备所得的伍尔夫型苯硼酸功能化磁珠适用于从复杂样品基质中富集分离多种细菌，如食品、环境或医院样品等。食品样品包括各类新鲜或冷冻加工后的食品材质，如新鲜蔬菜、肉类、海鲜类等产品；环境样本包括污水、土壤等；医院样本包括各类医院感染样品，如血样、脑脊液、腹水等。样品处理按照常规处理方法即可，如固体样品粉碎后制成待测溶液，液体样本可直接稀释制成待测溶液。

技术特征：

1.一种伍尔夫型苯硼酸功能化磁珠的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述纳米磁珠的粒径为160-200nm。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤2)中，edc和nhss的质量比为2.90:3.26。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述洗涤、重悬均采用无菌pbs溶液。

5.根据权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于：所述无菌pbs溶液的浓度为0.01m，ph为7.4。

6.根据权利要求1-5任一项所述制备方法所制得的伍尔夫型苯硼酸功能化磁珠。

7.一种由权利要求1-5任一项所述制备方法所制得的伍尔夫型苯硼酸功能化磁珠或权利要求6所述伍尔夫型苯硼酸功能化磁珠在细菌分离中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：伍尔夫型苯硼酸功能化磁珠加入含细菌的样本溶液中，在37℃条件下，以100-300rpm，混匀孵育10-40min，然后插入磁力架分离4-5min，分离产物洗涤后重悬得到细菌-伍尔夫型苯硼酸-纳米磁珠复合物。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述细菌为革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种伍尔夫型苯硼酸功能化磁珠的制备方法及其应用。通过EDC和NHSS将纳米磁珠表面的羧基活化，然后再利用活化后的羧基与伍尔夫型苯硼酸上的氨基进行共价结合，将伍尔夫型苯硼酸偶联到纳米磁珠表面，得到伍尔夫型苯硼酸功能化磁珠，该制备方法简单，耗时短且成本低。该伍尔夫型苯硼酸功能化磁珠与细菌表面的顺氏二醇结构具有较强的亲和力，属于广谱性识别细菌的分子识别剂，适用于各类环境，且具有较高的分离效率。

技术研发人员：许恒毅,徐倩,肖芳斌,李伟强,白雪锟,黄瑾,凌智明,杨璐毓
受保护的技术使用者：南昌大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15