纳米抗体农药残留检测试纸条的制作方法

本发明涉及抗体技术和生物医药领域，特别是将纳米抗体应用于农药残留的快速检测。

背景技术：

1、抗体对抗原具有特异性结合的能力，能够识别不同的蛋白大分子化合物和与载体蛋白偶联的小分子化合物，在检测和诊断领域有广泛的应用，市场上不乏针对各种蛋白和小分子化合物偶联蛋白的抗体。在检测方面，食品安全监管需要及时检测农药残留（如克百威、氟虫腈）、非法添加物（如三聚氰胺）等，各种基于免疫层析原理的快速检测试纸条由于简单、方便、快速、价廉，在食品监管上发挥了巨大作用。在临床诊断方面，免疫检测是重要的检测技术。在治疗药物方面，抗体已经成为重要的药物种类，不仅抗体本身可以作为药物，而且抗体药物还包括了由抗体衍生的抗体-毒素蛋白偶联体（immunotoxin）、抗体-药物偶联体（antibody-drug conjugate, adc）、双抗和多抗（bispecific antibody, multi-specific antibody），等。

2、抗体分为多克隆抗体和单克隆抗体，我们统称为常规抗体。多克隆抗体由免疫动物产生，为抗体的混合物，各批次间的抗体组成不同，效价有差异。单克隆抗体由单一基因产生，动物细胞生产，克服了多克隆抗体的批间次差异的问题。但单克隆抗体存在以下特点和不足：研发周期长，生产周期长，制备成本高，在机体内不易被清除，穿透能力弱。

3、纳米抗体是常规抗体的简化形式，早期在羊驼等动物的抗体中发现一种罕见的、只有重链的抗体，通过仅保留与抗原结合的单个结构域，构建成为大小在纳米级别的纳米抗体，又称为单域抗体。纳米抗体保留了常规抗体对抗原的高亲和性和高特异性，还有以下优点：单个结构域的稳定性高；能够在原核或真核细胞中高效表达；在原核细胞（如大肠杆菌）表达时，生长周期短、制备成本低；对人的免疫原性弱；分子量小，穿透能力强，甚至可以穿透血脑屏障。纳米抗体在生物医药中得到了越来越广泛的应用，如获批上市的双特异性纳米抗体ozoralizumab，利用抗人血清白蛋白的纳米抗体对白蛋白的高亲和性，来延长在体内的存留时间，同时利用另一个融合在一起的抗肿瘤坏死因子tnfα的纳米抗体，靶向药物作用分子，用于治疗类风湿性关节炎。然而，纳米抗体在检测和诊断领域还没有得到广泛应用，纳米抗体的检测和诊断产品极其罕见。

4、克百威（carbofuran, car），又名呋喃丹、虫螨威，属氨基甲酸酯类农药，为内吸性广谱型杀虫、杀螨剂，具有触杀和胃毒的作用。主要抑制乙酰胆碱酯酶的活性，依靠抑制剂对酶活性部位的亲和力形成酶活性抑制剂，从而破坏正常的神经冲动传导。可用于防治水稻、花生、甘蔗、棉花等作物的大部分害虫，主要为内吸杀虫作用。克百威与其他氨基甲酸酯类杀虫剂所不同的是，其与乙酰胆碱酯酶的结合是不可逆的，因此克百威毒性高，一旦暴露与环境中，残留时间较长，对鸟类、蜜蜂和水生动物如鱼类具有高度毒性。

5、多菌灵（carbendazim, cbd）是一种广泛使用的广谱苯并咪唑类杀菌剂，也是苯菌灵的代谢产物，又名棉萎灵、苯并咪唑44号。可以有效防治由真菌引起的多种作物病害，但其残留能引起肝病和染色体畸变，对哺乳动物有毒害。

6、啶虫脒（acetamiprid，atp）是一种烟碱类杀虫剂，除了具有触杀和胃毒作用之外，还具有较强的渗透作用，显示出速效的杀虫力。主要对黄瓜、苹果、柑桔、烟草上的蚜虫具有较好的防治效果。由于啶虫脒作用机制独特，对有机磷、氨基甲酸酯，以及拟除虫菊酯类等农药品种产生抗药性的害虫也具有较好效果。

7、氟虫腈（fipronil, fpn）是一种用于有害生物防治的苯吡唑类杀虫剂、杀虫谱广，对害虫以胃毒作用为主，兼有触杀和一定的内吸作用，其作用机制在于阻碍昆虫γ-氨基丁酸控制的氯化物代谢，因此对蚜虫、叶蝉、飞虱、鳞翅目幼虫、蝇类和鞘翅目等重要害虫有很高的杀虫活性。

8、食品安全国家标准，食品中农药最大残留限量（gb2763-2021，发布日期2021.3.3，实施日期：2021.9.3），对克百威、多菌灵、啶虫脒、和氟虫腈等农药残留的限量都有明确规定。因此，使用纳米抗体农药残留检测试纸条，快速检测农药残留，有很大的需求。

技术实现思路

1、本发明是提供一个利用纳米抗体构建用于农药残留检测的免疫层析试纸条的技术方案。采取所述技术方案，用纳米抗体农药残留检测试纸条，可以准确、方便、快速地检测样本中的农药残留。纳米抗体农药残留检测试纸条具有生产成本低、产品稳定性好、易于保存、显色明显、便于观察、等特点。

2、本发明的首要目的是提供了一个构建免疫层析试纸条的技术方案。抗原和抗体的特异性结合是免疫反应的关键之处。所述技术方案中，抗原为农药偶联蛋白，即农药小分子化合物与载体蛋白形成的偶联蛋白。优选的载体蛋白包括牛血清白蛋白（bovine serumalbumin, bsa）、卵清蛋白（ovalbumin, ova）、和血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin,klh）。农药包括克百威、多菌灵、啶虫脒、和氟虫腈，以及其他小分子农药化合物。所述技术方案中，抗体为两个，一个是常规抗体，另一个是纳米抗体。常规抗体是针对农药偶联蛋白的抗体，可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，但要求是鼠源的、带有鼠抗体的可结晶段。纳米抗体必须是针对鼠抗体可结晶段的纳米抗体，不仅能够与鼠抗体的可结晶段有效结合，而且具有与鼠抗体的可结晶段结合的特异性。作为优选，所述纳米抗体是我们先前得到的纳米抗体mx21和纳米抗体my50（见专利申请：叶其壮等人，申请号cn2023105594931）。纳米抗体mx21和纳米抗体my50结合在鼠抗体可结晶段的两个不同的表位，因此，纳米抗体mx21和纳米抗体my50可以单独使用，也可以用1:2与2:1之间的任何比例组合成混合物使用。

3、具体的，免疫层析试纸条的构造包括样本垫、结合垫、层析垫、吸收垫、底板，样本垫、结合垫、层析垫、吸收垫依次相互重叠2毫米粘贴在底板上。在结合垫上，吸附有彩色标记的常规抗体，彩色标记是以便于肉眼观察为目的，包括采用胶体金、胶体银、胶体碳和各种颜色的彩色微球。优选采用胶体金来标记常规抗体，显红色（或酒红色），带有胶体金标记的常规抗体的结合垫又称金标垫。在层析垫上，平行设置两条线，检测线t线和质控线c线；所述t线含有农药偶联蛋白，所述c线含有纳米抗体。作为优选，c线处于靠近吸收垫的一端，t线处于靠近结合垫的一端。当常规抗体的彩色标记采用胶体金时，t线和c线显红色条带。

4、按本技术方案构建的免疫层析试纸条，在对结果的判读时，是通过比较t线和c线色度的相对强弱，来确定样本中农药的量。在t线处，固定有农药偶联蛋白；层析展开的彩色标记的常规抗体与t线处的农药偶联蛋白结合，截留彩色标记的常规抗体而显色，t线的色度随样本中农药的量的增加而减弱。在c线处，固定有针对鼠抗体可结晶段的纳米抗体，彩色标记的常规抗体在层析经过t线后，未与t线上农药偶联蛋白结合的、彩色标记的常规抗体继续层析展开，到达c线时，由固定在c线的纳米抗体捕获，c线的色度反映了捕获的彩色标记的常规抗体的量，随样本中农药的量的增加而增强。判读的目标值根据农药残留检测的限量设定。样本中，当农药的浓度达到或超过目标值时，c线的色度强于t线的色度，为阳性结果；当农药的浓度小于目标值时，t线的色度强于c线的色度，或两条线的色度接近，为阴性结果。

5、按本技术方案构建的免疫层析试纸条，俗称“裸条”，即“条型”，制造简单、生产成本低廉、使用也很方便，是一种优选的产品包装形式。另一种优选的包装形式是将试纸条装入塑料卡壳内，称为免疫层析试纸卡，即“卡型”。卡型与条型是相同的农药残留检测产品、不同的包装方式；条型产品是裸露的试纸条，检测时，将试纸条直接竖直插入样本溶液；卡型产品则是在检测时，将样本溶液加至试纸卡的加样孔。以上两种取样方式都是将样本溶液加到试纸条的样本垫上。取样后，样本溶液与彩色标记的常规抗体混合，在试纸条上一同层析展开。

6、按本技术方案构建的免疫层析试纸条或免疫层析试纸卡，可以方便地应用于通过检测样本溶液里的农药残留量，来实现食品中农药残留的快速检测。

7、本发明采用新型的生物材料纳米抗体，构建能够准确、方便、快速地检测食品中的农药残留量。本发明的显著益处包括：（1）稳定性。稳定性是纳米抗体相对于常规抗体的一大优点，本发明基于纳米抗体构建的免疫层析试纸条显示出可以长时间耐受高温的热稳定性。由于优异的热稳定性，产品更便于储存和运输；（2）经济性。市面上同类免疫层析试纸条产品常用的是动物产生的单克隆和多克隆的常规抗体。本技术方案采用大肠杆菌产生的基因重组的纳米抗体，不仅生产需要的时间降低，而且生产的成本也大大降低。（3）一致性。纳米抗体是基因工程产品，由同一基因表达产生，属于单克隆，一致性良好，减少了批间次的差异。（4）准确性。本发明基于纳米抗体构建的免疫层析试纸条采用两条显色条带色度变化相向而行的方式，提高了对结果判断的准确性。使得对结果的判定更加容易。