一种人心肌肌钙蛋白I含量均相快速测定方法及其应用与流程

本发明属于免疫分析，具体涉及一种均相免疫检测试剂盒及其制备方法、使用方法、检测系统及其在人心肌肌钙蛋白i检测中的用途。

背景技术：

1、目前，生物大分子人心肌肌钙蛋白i(ctni)检测常用elisa法、胶体金法等。免疫分析方法是利用抗原与抗体特异性结合而建立的高选择性生物化学方法。免疫分析根据标记与否分为标记免疫分析法和非标记免疫分析法。由于标记物的引入，不可避免地带来了结合的抗原-抗体与过量的抗原或抗体的分离问题，因而标记免疫分析法根据分离与否又分为均相免疫分析法和非均相免疫分析法。非均相免疫分析法需要包埋、洗脱、分离等多步操作，分析过程繁琐，分析时间长，不能满足快速检测和诊断的要求。均相法则有效避免了洗脱、分离等繁琐步骤，极大提高了分析效率和性价比，得到日益广泛的应用，具有取代传统非均相免疫分析的潜力。

2、非均相免疫分析是指抗体-抗原反应后、检测信号前，需要分离去除未参加反应的、游离状态的标记抗体或其他组分；此时，检测结合状态的结合标记物的信号强度，可通过数学函数可获得待测抗原或抗体的含量。分离结合标记物和游离标记物常用的方法是固相吸附分离技术。针对ctni定量分析而言，将捕获抗体与固相载体连接，待检抗原分别与标记抗体和捕获抗体结合，于固相材料表面形成双抗体夹心复合物(结合标记物位于固相表面)，而过量的、未参与抗原抗体反应的游离标记抗体分布于液相中。去除液相溶液、并反复洗涤固相(微粒)，可有效去除游离状态标记抗体。固相吸附分离方法有两个重要环节：包被和洗涤。此种非均相反应模式因包被和洗涤环节的存在，给标记免疫分析造成很大缺陷，例如：操作步骤麻烦，检测范围较窄，检测的精密度较差，容易出现批间、批内差异。

3、尽管目前已经公开报道了一些非均相检测ctni的方法，但是他们的共同特点是检测时间较长，消耗检测人员大量时间，且检测灵敏度也相对较低。

4、出于这种考虑，本发明的发明人进行了研究，期望提供一种快速均相检测ctni的方法、试剂盒及其应用。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了一种制备快速检测ctni的均相免疫试剂盒的方法，由该方法获得的试剂盒能够快速检测待测样本中的ctni，检测时间可缩短至10min以内，但同时检测灵敏度却能达到5pg/ml，还克服了“钩状效应”的缺陷。

2、本发明第一方面提供了一种人心肌肌钙蛋白i均相快速检测试剂盒的制备方法，所述制备方法包括：

3、制备第一组分，所述第一组分包含受体以及与之结合的第一结合单元，所述受体能够与单线态氧反应生成可检测信号，所述第一结合单元能够结合人心肌肌钙蛋白i的第一表位；

4、制备第二组分，所述第二组分包含第一标记物以及与之结合的第二结合单元，所述第二结合单元能够结合人心肌肌钙蛋白i的第二表位，所述第二表位与所述第一表位是人心肌肌钙蛋白i的不同结合特性的表位或者不同位置的相同结合特性的表位；

5、制备第三组分，所述第三组分包含供体以及与之结合的所述第一标记物的特异结合物，所述供体能够在激发状态产生单线态氧。

6、在本发明的一些实施方案中，所述第一结合单元和所述第二结合单元分别独立选自与人心肌肌钙蛋白i具有结合特异性的多克隆抗体、单克隆抗体、抗体结合片段、人工抗体、修饰的抗体，优选选自多克隆抗体和/或单克隆抗体。

7、在本发明的一些实施方案中，所述第一结合单元和/或所述第二结合单元独立包含至少两种能够与人心肌肌钙蛋白i的不同结合特性的表位或者不同位置的相同结合特性的表位具有结合特异性的不同的单克隆抗体、抗体结合片段、人工抗体或修饰的抗体。

8、在本发明的一些实施方案中，所述第一标记物为生物素，所述第一标记物的所述特异结合物为链霉亲和素。

9、在本发明的一些实施方案中，所述受体包含烯烃化合物和金属螯合物，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述受体为填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒。

10、在本发明的一些实施方案中，所述供体为光活化的或化学活化的敏化剂，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述供体为填充有感光化合物的高分子微粒，在光激发下能够产生单线态氧。

11、在本发明的一些实施方案中，制备第一组合物，所述第一组合物包括所述第一组分和第一缓冲液；

12、制备第二组合物，所述第二组合物包括所述第二组分和第二缓冲液；

13、制备第三组合物，所述第三组合物包括所述第三组分和第三缓冲液。

14、在本发明的一些实施方案中，所述第一结合单元与所述受体间接结合；优选地，所述第一结合单元与所述受体通过异硫氰酸荧光素-异硫氰酸荧光素抗体系统间接结合。

15、在本发明的一些实施方案中，所述第一组合物、所述第二组合物与所述第三组合物中的任一个、任两个或三个还包含表面活性剂，优选非离子表面活性剂，更优选直链非离子表面活性剂，最优选聚乙二醇型直链非离子表面活性剂。

16、在本发明的一些实施方案中，所述第三组合物中的表面活性剂的重量体积浓度为0.001％-0.1％，优选0.01％-0.04％，更优选0.02％。

17、本发明第二方面提供了一种用于均相检测人心肌肌钙蛋白i的试剂盒，所述试剂盒是根据本发明第一方面所述的人心肌肌钙蛋白i均相快速检测试剂盒的制备方法制备得到的。

18、在本发明的一些实施方案中，所述第一组合物中的所述第一组分的浓度选自20～300μg/ml，优选30～200μg/ml，更优选40～100μg/ml。

19、在本发明的一些实施方案中，所述第二组合物中的所述第二组分的浓度选自：0.2～10μg/ml，优选0.5～8μg/ml，更优选1～6μg/ml。

20、本发明第三方面提供了一种人心肌肌钙蛋白i均相快速检测的方法，所述方法是用于非诊断目的的，包括使用本发明第二方面所述的试剂盒进行化学发光检测。

21、在本发明的一些实施方案中，其包括如下步骤：

22、步骤s1，同时或完全或依次组合：

23、a.疑似含有人心肌肌钙蛋白i的待检测样本；

24、b.第一组合物，所述第一组合物包括第一组分和第一缓冲液；所述第一组分包含受体以及与之结合的第一结合单元，所述受体能够与单线态氧反应生成可检测信号，所述

25、第一结合单元能够结合人心肌肌钙蛋白i的第一表位；

26、c.第二组合物，所述第二组合物包括第二组分和第二缓冲液；所述第二组分包含第一标记物以及与之结合的第二结合单元，所述第二结合单元能够结合人心肌肌钙蛋白i

27、的第二表位，所述第二表位与所述第一表位是人心肌肌钙蛋白i的不同结合特性的表位

28、或者不同位置的相同结合特性的表位；

29、d.第三组合物，所述第三组合物包括第三组分和第三缓冲液；所述第三组分包含供体以及与之结合的所述第一标记物的特异结合物，所述供体能够在激发状态产生单线态氧；

30、步骤s2，将v1体积待检测样本与v2体积所述第一组合物和v3体积所述第二组合物混合后进行第一反应，得到第一混合物；控制所述反应的温度为k1以及反应的时长为t1；

31、步骤s3，将所述第一混合物与所述第三组合物混合后进行第二反应，得到第二混合物；控制所述反应的温度为k2以及反应的时长为t2；

32、步骤s4，利用能量或者活性化合物激发所述第二混合物中的所述供体产生单线态氧，所述受体能够与接收到的单线态氧反应生成可检测的化学发光信号，通过检测化学发光信号的存在和/或强度，从而确定待检测样本中是否含有人心肌肌钙蛋白i和/或人心肌肌钙蛋白i的含量；

33、其中，t1≤15min，t2≤5min，且t1+t2≤15min。

34、在本发明的一些实施方案中，步骤s2中，首先将待检测样本与所述第一组合物混合后得到第三混合物，然后再将所述第三混合物与所述第二组合物混合后得到所述第一混合物。

35、在本发明的一些实施方案中，所述k1和/或k2的温度分别独立地选自35-45℃，优选选自37-42℃。

36、在本发明的一些实施方案中，所述t1≤12min；优选地，所述t1≤10min；进一步优选地，所述t1≤8min；更优选地，所述t1≤6min。

37、在本发明的一些实施方案中，所述t2≤3min；优选地，所述t2≤2min。

38、在本发明的一些实施方案中，所述t1+t2≤13min；优选地，所述t1+t2≤12.5min；进一步优选地，所述t1+t2≤10min；更优选地，所述t1+t2≤8min。

39、在本发明的一些实施方案中，所述t1为8min，所述t2为2min。

40、在本发明的一些实施方案中，5≤v1≤100μl，优选20≤v1≤120μl，更优选40≤v1≤100μl。

41、在本发明的一些实施方案中，5≤v2≤50μl，优选8≤v2≤40μl，更优选10≤v2≤25μl。

42、在本发明的一些实施方案中，5≤v3≤50，优选8≤v3≤40μl，更优选10≤v3≤25μl。

43、在本发明的一些实施方案中，所述方法的检测灵敏度小于等于5pg/ml。

44、在本发明的一些实施方案中，在步骤s4中，使用600-700nm波长的激发光照射所述第二混合物物，激发所述供体产生单线态氧，所述受体与接触到的单线态氧反应生成520-620nm的发射光，通过检测发射光信号的存在和/或强度，从而判断待检测样本中是否存在人心肌肌钙蛋白i和/或确定人心肌肌钙蛋白i的含量。

45、本发明第四方面提供了一种人心肌肌钙蛋白i均相快速检测装置，其利用本发明第二方面所述的试剂盒或者发明第三方面所述的检测的方法检测人心肌肌钙蛋白i。

46、在本发明的一些实施方案中，其包括如下部分：加样模块、试剂模块、温育模块、检测模块以及电路控制模块；所述温育模块、所述试剂模块、所述加样模块、所述温育模块以及所述检测模块均与所述电路控制模块电连接。

47、在本发明的一些实施方案中，所述试剂模块包括用于加入第一组合物的第一组件以及用于加入第二组合物的第二组件。

48、本发明第五方面提供了本发明第二方面所述的试剂盒或者本发明第三方面所述的检测的方法或者本发明第四方面所述的装置在poct检测技术中的应用。

49、本发明第六方面提供了一种本发明第二方面所述的人心肌肌钙蛋白i均相快速检测试剂盒或本发明第三方面所述的方法在检测待检测样本中人心肌肌钙蛋白i的存在与否和/或含量中的应用。

50、本发明第七方面提供了一种本发明第一方面所述的方法在制备用于检测怀疑患有心肌损伤的受治疗者或待体检者的待检测样本中的人心肌肌钙蛋白i，由此确定待检测样本中人心肌肌钙蛋白i的水平，并将由此确定的水平与受治疗者的心肌损伤的存在、风险、潜在性或倾向性相关联的试剂盒中的应用。

51、本发明中试剂盒具备的技术效果：线性好。灵敏度好。准确度高。检测限低。检测耗时短。