一种麝香通心滴丸中胆酸类入血成分的定量检测方法与流程

本技术方案属于复方中药成分检测领域，具体涉及麝香通心滴丸入血成分的定量检测。

背景技术：

1、麝香通心滴丸由人工麝香、人参茎叶总皂苷、蟾酥、丹参、熊胆粉、人工牛黄和冰片7味药材组成，具有芳香开窍、益气温阳、理气止痛之效，用于冠心病稳定型劳累性心绞痛，中医辨证气虚血瘀证，症见胸痛胸闷，心悸气短，神倦乏力。其中，人工麝香和蟾酥芳香通脉、缓急止痛，为君药；人参茎叶总皂苷和丹参补益心气、活血化瘀，为臣药；人工牛黄和熊胆粉清脉凉开、化痰逐淤，为佐药；冰片开窍醒神，与麝香相须为用，引诸药入心络。

2、“血清药物化学”这一理论最先由德国科学家格哈德·多马克提出，后由我国科学家王喜军教授提出符合中医药理论的中药血清药物化学。中药化学成分极其复杂，口服后部分成分经肠道和肝脏代谢酶代谢后吸收入血进而发挥效应。人工牛黄和熊胆粉作为佐药，具有引导诸药至病所，协助君、臣药以加强治疗的作用，对应的入血成分对疾病治疗发挥着重要作用。

3、人工牛黄与熊胆粉中均有胆酸类成分。其中，人工牛黄由牛胆粉、胆酸、猪去氧胆酸、牛磺酸、胆红素、胆固醇、微量元素等加工制成。对应胆酸类成分包括甘氨胆酸、牛磺胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、牛磺去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸等。熊胆粉中牛磺熊去氧胆酸(tudca)和牛磺鹅去氧胆酸(tcdca)的含量最高，二者的含量占比高达90％以上。此外，熊去氧胆酸(udca)是熊胆粉的特征性成分，同时也是现代医学治疗胆汁淤积性疾病的临床一线药物(商品名：优思弗)。胆酸类入血成分的定量检测对药品有效成分的研究和药代动力学研究具有重要意义。

4、麝香通心滴丸的胆酸类入血成分定性检测方法已有公开，但定量检测暂无报道。《基于血清药物化学与网络药理学探究麝香通心滴丸治疗冠心病的机制》(中成药，2020,42(10),2768-2777)公开了血清样本用甲醇提取，浓缩后经hplc-q-tof/ms联用检测。其中，hydro-rp c18色谱柱(250mm×4.6mm,4μm)；流动相0.4％甲酸乙腈-0.2％甲酸，梯度洗脱；离子源esi，扫描方式esi+/esi-模式；干燥气体温度320℃，体积流量10l/min，鞘气温度350℃，体积流量12l/min，碎裂能量175v，毛细管电压3kv，正负离子采集范围m/z 50～1500。该技术方案能定性检测沙蟾毒精，牛磺胆酸，远华蟾毒精，甘氨胆酸，去乙酰华蟾毒精，蟾毒灵，熊去氧胆酸和脂蟾毒配基。但该技术方案能同步检测的胆酸类入血成分种类较少，且无法定量。

5、麝香通心滴丸药物成分的定量检测也有报道，但检测的胆酸种类较少。《qualitative and quantitative analysis of the major constituents in shexiangtongxin dropping pill by hplc-q-tof-ms/ms and uplc-qqq-ms/ms(hplc-q-tof-ms/ms和uplc-qqq-ms/ms定性定量分析麝香通心滴丸中主要成分)》(molecules.2015,20(10):18597-619)中采用流动相乙腈和水梯度洗脱，对麝香通心滴丸提取物进行主要成分分析，定量检测了人参皂苷rg1，人参皂苷rk3，华蟾毒精，沙蟾毒精，蟾毒灵，脂蟾毒配基，丹参酮iia，牛磺酸，牛磺熊去氧胆酸，牛磺胆酸，胆酸，去氧胆酸和鹅去氧胆酸。但入血成分不等于药物成分原型。药物原型化合物入血后根据代谢途径不同、酶种类不同、酶解程度不同会产生不同的代谢产物，不能通过药物原型结构式进行简单推断。因此，用于药物成分原型的检测方法不一定适用于入血成分的检测。

6、此外，其他内源性成分的干扰加大了胆酸入血成分的检测难度。cn113960222a“基于血清样本的胆汁酸全通路代谢轮廓的检测方法及其应用”(申请日：2021.12.23；公开日：2022.01.21)采用液相色谱的条件包括：流动相为a：0.1％甲酸-水，b：0.1％甲酸-乙腈；色谱柱为碳十八柱，流速为0.4ml/min，柱温为40℃，质谱的条件包括：检测时间0～19.5min，离子扫描范围50～1200da，碰撞能量20～50v，锥孔电压25v，脱溶剂气流速800l/h，脱溶剂气温度450℃，锥孔气流速50l/h，离子源温度100℃，毛细管电压2kv，采集模式为负离子模式。经检测，胆固醇以经典途径在肝脏中产生约占75％总胆汁酸量的胆酸及鹅去氧胆酸；胆固醇以替代途径被代谢为27-羟基胆固醇、25-羟基胆固醇及24(s)-胆固醇；27-羟基胆固醇进而代谢得到鹅去氧胆酸；鹅去氧胆酸进一步在肝脏中转化为熊去氧胆酸、猪胆酸、α-鼠胆酸；熊去氧胆酸进一步在肝脏中转化为β-鼠胆酸；胆酸、鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、猪胆酸、α-鼠胆酸、β-鼠胆酸分别与甘氨酸和牛磺酸结合形成结合型胆汁酸：甘氨胆酸、牛磺胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、甘氨熊去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸、甘氨猪胆酸、牛磺猪胆酸、牛磺-α-鼠胆酸、甘氨-β-鼠胆酸、牛磺-β-鼠胆酸。由此可见，胆固醇在肝脏中通过不同代谢途径产生不同的胆酸类化合物。其他内源性胆酸类化合物与入血胆酸成分的结构可能相近，因此检测人工牛黄和熊胆粉胆酸类入血成分时需要解决其他内源性成分的干扰问题。

7、现有技术中报道了人工牛黄与熊胆粉单味药材的成分检测。但中药复方中麝香通心滴丸中人工牛黄与熊胆粉用量较少，且其他药材入血成分复杂，对检测结果产生很大干扰。复方中药入血成分相比单味药材入血成分更复杂，组方不同对应的入血成分存在较大区别。药材配伍过程中存在药味、适应症等的变化，由此产生药效成分的变化。

8、如上所述，现有技术中没有报道定量检测麝香通心滴丸中胆酸类入血成分，对单味药材的药效成分研究脱离了中医整体协同作用的理论，不利于复方中药药效的整体评价。因此，需要建立一种麝香通心滴丸中胆酸类入血成分的定量检测，用于判断人工牛黄和熊胆粉的入血及起效、代谢的情况。

技术实现思路

1、本发明为解决现有技术中麝香通心滴丸入血成分含量低、成分复杂、检测困难的问题，提供一种麝香通心滴丸中胆酸类入血成分的定量检测方法，该方法采用超高效液相色谱-串联质谱(uplc-ms/ms)同步检测14种麝香通心滴丸中人工牛黄和熊胆粉的胆酸类入血成分，包括牛磺猪去氧胆酸(thdca)，牛磺熊去氧胆酸(tudca)，牛磺胆酸(tca)，甘氨胆酸(gca)，甘氨猪去氧胆酸(ghdca)，牛磺鹅去氧胆酸(tcdca)，牛磺脱氧胆酸(tdca)，胆酸(ca)，甘氨鹅去氧胆酸(gcdca)，熊去氧胆酸(udca)，猪去氧胆酸(hdca)，甘氨脱氧胆酸(gdca)，鹅去氧胆酸(cdca)和去氧胆酸(dca)。

2、此外，本发明还采用氘代-胆酸作为内标，提高分析结果的准确度，为进一步研究药物代谢周期及有效成分研究提供基础。

3、本发明采用的技术方案如下：

4、1、一种麝香通心滴丸中胆酸类入血成分的定量检测方法，其特征在于，所述检测方法包括超高效液相色谱-串联质谱分析，其中液相色谱条件中采用碳十八填料色谱柱，流动相a为0.05％～0.2％甲酸水，流动相b为0.05％～0.2％甲酸乙腈，梯度洗脱程序如下：

5、 时间(min) b(％) 0 37～43 9.5 67～73 9.6 37～43 11 37～43

6、柱温30～40℃，流速为0.1～0.3ml/min；优选的，柱温为35℃，流速为0.25ml/min。

7、所述质谱分析条件包括：电喷雾离子源，负离子模式，多反应监测模式，干燥气温度为300～400℃，干燥气流量为4～8l/min，鞘气温度为300～400℃，鞘气流量为8～12l/min，雾化气压力为40～50psi，毛细管入口电压为3～4kv，锥孔电压为450～550v，碰撞能量10～40ev，碎裂电压100～250v。

8、优选的，流动相a为0.1％甲酸水，流动相b为0.1％甲酸乙腈，梯度洗脱程序如下：0min，40％b；9.5min，70％b；9.6min，40％b；11min，40％b；干燥气温度为350℃，干燥气流量为6l/min，鞘气温度为350℃，鞘气流量为11l/min，雾化气压力为45psi，毛细管入口电压为3.5kv。

9、优选的，胆酸类入血成分的质谱参数如表1所示：

10、表1胆酸类入血成分质谱参数

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13、进一步的，本发明还包含供试品前处理，具体包括：移取含药组织样品匀浆液或血浆，加入甲醇沉淀蛋白，涡旋，离心，取上清液供分析。优选的，含药组织样品匀浆为含药组织中加入磷酸缓冲盐溶液，匀浆后获得。

14、进一步的，胆酸类入血成分的定量采用标准品建立线性回归方程，计算供试品中各成分的含量。

15、进一步的，构建标准品曲线时，组织匀浆或血浆样品使用活性炭涡旋1～2h，再添加系列浓度的标准品溶液制得标准品。优选的，所述活性炭添加浓度为0.05～0.15g/ml。

16、本发明还提供了一种定量检测方法在麝香通心滴丸药物动力学分析的用途，其中药物动力学包括药代动力学试验。

17、本发明能同步检测麝香通心滴丸中胆酸类入血成分14种，其中包括人工牛黄和熊胆粉中的指标性成分，比如熊胆粉中的牛磺熊去氧胆酸(tudca)、牛磺鹅去氧胆酸(tcdca)和熊去氧胆酸(udca)；人工牛黄中的猪去氧胆酸(hdca)。此外也包含人工牛黄的代谢成分，比如牛磺猪去氧胆酸(thdca)和甘氨猪去氧胆酸(ghdca)。

18、其中，牛磺猪去氧胆酸和甘氨猪去氧胆酸是猪去氧胆酸与甘氨酸和牛磺酸结合形成的结合型胆汁酸。牛磺猪去氧胆酸钠盐可以通过阻断钙介导的凋亡通路和caspase-12的活化来阻止细胞凋亡，被用于原发性胆汁性肝硬化(pbc)，胰岛素抵抗，淀粉样变性，囊性纤维化，胆汁淤积和肌萎缩侧索硬化症等的研究。甘氨猪去氧胆酸是猪去氧胆酸的主要代谢产物，对胆结石的形成具有预防作用。上述两种胆酸化合物分别作为药效成分和代谢指标物，对麝香通心滴丸中人工牛黄的吸收和代谢的评价具有重要意义。现有技术未公开同步检测牛磺猪去氧胆酸和甘氨猪去氧胆酸的报道，原因在于上述两类成分在人工牛黄入血后代谢才同时产生，而且入血成分含量较低又结构相近，难以同时定量检测。本发明解决了麝香通心滴丸中入血及代谢成分含量低，检测难度大的问题。

19、此外，麝香通心滴丸中不同药材成分的口服生物利用度或代谢途径不同，血浆或不同组织中检测成分的浓度相比药材或药物中的含量更低。多种成分含量的难度相比药材或药物中检测的难度更大，对灵敏度和方法实用性提出更高的要求。

20、本发明的优势在于：

21、(1)本发明与现有技术相比实现了麝香通心滴丸中人工牛黄和熊胆粉入血成分的同步检测，定量检测14种胆酸类化合物，降低内源性结构相似核酸的检测干扰，且检测灵敏度高。

22、本发明无需对样品浓缩纯化，直接采用甲醇去除血浆或组织匀浆液中蛋白，取上清液检测成分浓度。本发明构建的超高效液相法-串联质谱法能实现上述14种胆酸类入血成分的定量检测。上述14种成分为内源性成分，本发明使用活性炭吸附过的空白血浆或组织匀浆作为替代基质进行了线性拟合；同时采用正常空白血浆或组织匀浆进行线性拟合后对比。试验结果表明，替代基质与真实基质回归曲线的斜率基本一致，检测范围相同。其中，血浆中gdca定量检测下限为4ng/ml，gcdca定量检测下限为10ng/ml，其余胆酸类成分定量检测下限为20～60ng/ml；组织中gdca定量检测下限为8ng/ml，gcdca定量检测下限为20ng/ml，其余胆酸类成分定量检测下限为40～120ng/ml。

23、由于牛磺猪去氧胆酸(thdca)和牛磺熊去氧胆酸(tudca)的化学结构相似，相同浓度下这两种化合物的响应基本相同且保留时间完全一致。因此选择thdca的线性回归方程作为两种化合物的线性回归方程，用thdca/tudca来表示thdca和tudca的总浓度。udca/hdca同理，选择udca的线性回归方程作为两种化合物的线性回归方程，用udca/hdca来表示udca和hdca的总浓度。不同化合物方法学验证的线性与范围如表2-表3所示：

24、表2血浆中不同化合物检测方法验证的线性与范围

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26、表3组织匀浆中不同化合物方法学验证的线性与范围

27、

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29、本发明建立的含量检测方法不仅能降低内源性结构相似核酸对目标胆酸检测的干扰，还能检测血浆或组织匀浆样品中内源性胆酸和药物入血胆酸成分含量；另外，本发明也实现了对于结构相似的同分异构体牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸和牛磺脱氧胆酸的分离和检测。本发明提供的含量检测方法具有检测指标数量多，检测结果可靠且灵敏度高的特点。

30、(2)本发明提供的检测方法对于长期冻存、多次冻融样品的定量检测具有较高的准确度和精密度，稳定性好。

31、考虑药物动力学试验中血浆、组织取样的时间间隔短且检测样本量大的情况，对样本进行冻存后检测是常规实验过程中存在的现象。本发明提供的检测方法对长期冻存的样品仍具有较好的准确度和精密度，满足实际药效动力学试验中对检测稳定性需求。血浆和组织中不同化合物长期冻存及冻融结果如表4和表5所示。

32、表4血浆中不同化合物方法学验证的冻存及冻融稳定性结果(n＝3)

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35、表5组织匀浆中不同化合物方法学验证的长期冻存及冻融稳定性结果(n＝3)

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37、本发明建立的血浆定量测定方法为ng/ml数量级，组织定量测定方法为ng/g数量级的浓度。由此，本发明检测对象和结果同时满足基质复杂、多成分分析及组分含量低于0.0001％的条件。根据中国药典2020版要求，回收率限度可放宽至70-125％；且为了能尽可能多地测定一些成分，我们将部分被测成分的准确度要求放宽至±30％。因此，质控样品的测定基本符合准确度在±30％范围内和精密度小于15％的要求，表明该方法重复性好，测量的结果准确可靠。

38、(3)本发明超高效液相色谱-串联质谱检测时间只需11min，前处理仅通过甲醇除蛋白，操作简单。本发明用于血药浓度监测，检测时间短且前处理简单，更有利于取样、分析和推广。