一种小熊猫IgG酶标抗体的制备方法与流程

本发明属于酶标抗体，具体涉及一种小熊猫igg酶标抗体的制备方法。

背景技术：

1、小熊猫（ailurus fulgens）隶属食肉目，小熊猫科，特产于喜马拉雅山脉-横断山脉。目前，小熊猫已被列入《世界自然保护联盟濒危物种红色名录》（iucn）的濒危级别；在我国，小熊猫被列为国家二级保护动物。随着栖息地的破坏和缩小，小熊猫的野外数量剧减，小熊猫物种的保护工作迈入一个新的阶段。圈养条件下，传染病给小熊猫保护工作带来了巨大的挑战，建立特异性的诊断方法对于小熊猫传染病的防控意义重大。尽管针对犬瘟热、猫瘟热等传染病已建立了核酸检测方法，但目前诊断小熊猫疾病的血清学特异性检测方法较少，这与缺少小熊猫特异性抗体有关，尤其是商品化的小熊猫igg抗体的缺乏，严重制约了小熊猫疾病血清学检测方法的发展。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明旨在提供一种小熊猫igg酶标抗体的制备方法，该方法采用protein g亲和层析法提纯小熊猫血清igg，以纯化的小熊猫igg（h+l）作为抗原免疫山羊，制备山羊抗小熊猫igg（h+l）抗血清，并用抗原亲和层析方法进行纯化，过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶，即获得山羊抗小熊猫igg（h+l）酶标抗体。本发明制备的抗体可用于包括elisa、western-blot在内的多种免疫学检测方法，初步解决了小熊猫igg酶标抗体缺乏的现状，为小熊猫相关疾病的血清学检测技术的发展提供基础。

2、为达到上述目的，本发明的实施例采用如下技术方案：

3、本发明提供一种小熊猫igg酶标抗体的制备方法，包括如下步骤：

4、a、采集小熊猫血液，离心收集血清，并采用protein g亲和层析法提纯得到小熊猫igg；

5、b、取步骤a得到的小熊猫igg与等量弗氏完全佐剂混合并充分乳化，皮下注射山羊进行首次免疫，首次免疫后间隔四周，取小熊猫igg与等量弗氏不完全佐剂乳化进行第二次免疫，随后每间隔三周按照第二次免疫方法进行加强免疫，直至山羊血清效价合格；

6、c、抽取山羊的血液，并离心沉淀分离出血清，即为山羊抗小熊猫igg多克隆抗体，-20℃冷冻保存；

7、d、对步骤c得到的山羊抗小熊猫igg多克隆抗体进行纯化；

8、e、向活化的hrp溶液中加入hrp偶联缓冲液，静置后加入步骤d中纯化的山羊抗小熊猫igg多克隆抗体，进行透析、还原，即得hrp标记的山羊抗小熊猫igg多克隆抗体。

9、在一些实施例中，在步骤a中，具体包括以下步骤：

10、a1、采集小熊猫血液，将血液置于37℃放置1 h后，并在4℃静置12 h-24h， 1500rpm离心10 min后收集上层血清，分装至不同的ep管中，-20℃保存；取不同个体，数量大于等于5只的小熊猫血清融化后混匀，用20 mm ph 7.0的磷酸缓冲液按体积稀释10倍，装入预处理的透析袋中4℃透析24 h，期间每隔6 h更换一次透析液，透析后的小熊猫血清再经0.45 μm滤器过滤后备用；

11、a2、向protein g层析柱中加入10倍柱体积结合缓冲液冲洗柱子中的乙醇和平衡柱子，以0.5-5 ml/min加入步骤a1透析后的小熊猫血清，然后加入5-10倍柱体积结合缓冲液冲洗柱子，接着加入2-5倍柱体积洗脱缓冲液进行洗脱，即得小熊猫igg。

12、在一些实施例中，在步骤b中，具体包括以下步骤：将3 mg纯化的小熊猫igg与等量弗氏完全佐剂混合，充分乳化后作为抗原分点皮下注射山羊进行首次免疫；首次免疫后间隔4周，取1.5 mg纯化的小熊猫igg与等量弗氏不完全佐剂乳化进行第二次免疫；此后，每间隔3周后按照二免方法加强免疫一次，二免后开始用间接elisa检测山羊血清效价，直到效价合格。

13、在一些实施例中，在步骤e中，具体包括以下步骤：向活化的hrp溶液中加入hrp偶联缓冲液，静置30 min后加入1 mg纯化的山羊抗小熊猫igg多克隆抗体，充分混匀并4℃透析12 h，透析后吸出透析袋中的液体，加入还原剂，室温静置2 h，即得hrp标记的山羊抗小熊猫igg多克隆抗体。

14、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

15、本发明采用protein g层析柱提纯小熊猫血清igg，经sds-page鉴定纯度后免疫山羊，制备山羊抗小熊猫igg（h+l）抗血清，并用抗原亲和层析法纯化山羊抗小熊猫igg（h+l）多克隆抗体，过碘酸钠法对纯化的山羊抗小熊猫igg（h+l）多克隆抗体进行hrp标记。结果显示：小熊猫血清igg经纯化后无明显杂质蛋白，使用bca蛋白定量试剂盒测得纯化后的小熊猫igg浓度为1.94-4.07 mg/ml。以纯化的小熊猫igg（h+l）免疫山羊，经五次免疫后山羊血清中抗小熊猫igg（h+l）的抗体效价达到期望水平。经hrp标记的山羊抗小熊猫igg（h+l）能有效识别小熊猫igg，表明成功制备了hrp标记的山羊抗小熊猫igg（h+l）酶标抗体，为小熊猫疾病血清学检测方法的研发提供基础。

技术特征：

1.一种小熊猫igg酶标抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤a中，具体包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤b中，具体包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤e中，具体包括以下步骤：

技术总结
本发明属于酶标抗体技术领域，具体涉及一种小熊猫IgG酶标抗体的制备方法，该方法采用Protein G亲和层析法提纯小熊猫血清IgG，以纯化的小熊猫IgG（H+L）作为抗原免疫山羊，制备山羊抗小熊猫IgG（H+L）抗血清，并用抗原亲和层析方法纯化山羊抗小熊猫IgG（H+L），过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶，即获得山羊抗小熊猫IgG（H+L）酶标抗体。本发明制备的抗体可用于包括ELISA、western‑blot在内的多种免疫学检测方法，初步解决了小熊猫IgG酶标抗体缺乏的现状，为小熊猫相关疾病的血清学检测技术的发展提供基础。

技术研发人员：王小兰,罗娌,吴星,罗泽娟,陈欣,黄文俊,廖礼慧,李碧,刘礼,文一帆
受保护的技术使用者：成都大熊猫繁育研究基地
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16