替普瑞酮的检测方法及替普瑞酮的检测试剂盒与流程

本技术属于生物样品中的药品检测，更具体地说，是涉及替普瑞酮的检测方法及替普瑞酮的检测试剂盒。

背景技术：

1、由于多数慢性胃炎患者无任何症状，因此难以获得确切的患病率，幽门螺杆菌现症感染者几乎均存在慢性活动性胃炎，绝大多数血清学检测(现症感染或既往感染)阳性者存在慢性胃炎，除幽门螺杆菌感染外，胆汁反流、药物、自身免疫等因素也可引起慢性胃炎。替普瑞酮胶囊适用于急性胃炎、慢性胃炎急性加重期的胃粘膜病变(糜烂、出血、潮红、浮肿)的改善；胃溃疡。

2、替普瑞酮属于胃粘膜保护剂，抗溃疡作用显著，不会对肠胃正常生理功能产生影响，确保胃酸正常分泌及正常胃动力。替普瑞酮通过促进胃粘膜分泌，内源性前列腺素生成及热休克蛋白hsp70表达。热休克蛋白hsp70能诱导炎症细胞凋亡，减轻机体炎症反应，并能修复受损的蛋白质，以此促使受损蛋白质修复。另外，替普瑞酮能增强胃粘膜分泌，以此提高胃粘膜屏障及保护功能，并能刺激胃粘膜再生，促进胃粘膜修复。替普瑞酮脂溶性高，其吸收需在胆汁酸乳化的帮助下进行，在空腹状态下几乎不吸收，所以，餐后服药的血浆中替普瑞酮的含量比空腹服药的血浆中替普瑞酮的含量高，目前该药物的临床药动学研究均在餐后条件下进行。

3、关于替普瑞酮检测的文献非常少，目前采用的检测方法的前处理大多采用固相萃取或液液萃取，然后将萃取物进行浓缩，待测物替普瑞酮的损失率高，导致检测结果误差大。

技术实现思路

1、基于此，本技术提供一种替普瑞酮的检测方法及替普瑞酮的检测试剂盒，以解决现有技术中存在的检测方法的前处理中待测物替普瑞酮的损失率高，导致检测结果误差大技术问题。

2、为实现上述目的，本技术采用的技术方案是：

3、第一方面，一种替普瑞酮的检测方法，包括预处理，预处理包括以下步骤：

4、提供含有替普瑞酮的血浆样品，将血浆样品与内标工作液进行混合，然后加入沉淀剂，沉淀剂包括甲醇和乙腈，进行蛋白沉淀，得到内标混合液；

5、将内标混合液进行固液分离处理，取清液，得到内标样品。

6、可选地，血浆样品包括待测样品和不同浓度的标准样品，预处理包括以下步骤：

7、将待测样品、标准样品分别与内标工作液进行混合处理，然后分别加入沉淀剂，进行蛋白沉淀，分别得到内标待测混合液、内标标准混合液；

8、将内标待测混合液、内标标准混合液分别进行固液分离处理，取清液，分别对应得到内标待测样品、内标标准样品。

9、可选地，进行预处理后，还包括以下步骤：

10、取不同浓度的内标标准样品，进行lc-ms/ms色谱检测，得到标准图谱，进行线性回归，得到血浆中替普瑞酮的线性回归方程及相关系数；

11、将内标待测样品在与内标标准样品相同的检测条件下进行lc-ms/ms色谱检测，得到内标待测样品的质谱分析结果，确定内标待测样品中替普瑞酮的含量。

12、可选地，lc-ms/ms色谱检测中，液相色谱的检测条件如下：

13、色谱柱：waters acquity uplc protein beh c4；

14、自动进样器温度：4℃-10℃；

15、柱温：30℃-50℃；

16、流速：0.3ml.min-1-0.4ml.min-1；

17、进样量：15μl-20μl；

18、流动相a相：ph为4-5的有机酸水溶液，有机酸为挥发性酸；

19、流动相b相：体积浓度为30％-60％的甲醇乙腈溶液；

20、洗脱方式为梯度洗脱；和/或，

21、lc-ms/ms色谱检测中，质谱的检测条件如下：

22、离子源：电喷雾离子源；

23、离子源温度：400℃；

24、源喷射电压：5000v；

25、入口电压：10v；

26、碰撞气：10psi；

27、气帘气：25psi；

28、离子源气体1：75psi；

29、离子源气体2：50.0psi；

30、电离模式：正离子；

31、信号采集模式：mrm；

32、电离模式：正离子；

33、离子对：

34、 离子对 q1(da) q3(da) 去簇电压(v) 碰撞能(v) 扫描时间(ms) 待测物 331.200 231.300 60.000 19.500 300.0 内标 334.200 234.300 55.000 16.000 300.0

35、。

36、可选地，梯度洗脱的程序包括：

37、提供质量百分含量为35％的流动相a相溶液，提供质量百分含量为65％的流动相b相溶液，于0-0.70min进行第一梯度洗脱；

38、提供质量百分含量为35％的流动相a相溶液，提供质量百分含量为65％的流动相b相溶液，于0.70min-3.00min进行第二梯度洗脱；

39、提供质量百分含量为5％的流动相a相溶液，提供质量百分含量为95％的流动相b相溶液，于3.00min-3.50min进行第三梯度洗脱；

40、提供质量百分含量为5％的流动相a相溶液，提供质量百分含量为95％的流动相b相溶液，于3.50min-3.51min进行第四梯度洗脱；

41、提供质量百分含量为35％的流动相a相溶液，提供质量百分含量为65％的流动相b相溶液，于3.51min-4.50min进行第五梯度洗脱。

42、可选地，不同浓度的标准样品包括浓度为0.75ng.ml-1-75.0ng.ml-1的标准样品；和/或，

43、不同浓度的标准样品的制备方法包括以下步骤：

44、提供替普瑞酮对照品储备液，用稀释剂进行稀释，得到不同浓度的标准曲线工作液；

45、将不同浓度的标准曲线工作液分别与空白血浆按照体积比小于或等于1:19进行混合处理，得到不同浓度的标准样品。

46、可选地，不同浓度的标准曲线工作液包括浓度为15ng.ml-1-1500ng.ml-1的替普瑞酮标准品的标准曲线工作液；和/或，

47、稀释剂包括质量百分浓度为60％-80％的乙腈水溶液。

48、可选地，预处理满足以下至少一个条件：

49、内标工作液中内标物质的浓度为0.5ng.ml-1-0.8ng.ml-1；

50、内标工作液的内标物质包括tep-13c3-yymmdd-is-02；

51、沉淀剂为体积浓度5％-8％的甲醇乙腈溶液；

52、固液分离处理包括离心分离；和/或，

53、检测方法还包括空白样品的预处理，空白样品的预处理方法包括以下步骤：

54、提供空白样品，向空白样品加入稀释剂，稀释至合适的浓度，然后加入沉淀剂，进行蛋白沉淀，得到空白样品混合液；

55、将空白样品混合液进行固液分离处理，取清液，得到空白对照样品；和/或，

56、血浆样品替换为血清样品或脑脊液样品。

57、可选地，血浆样品与沉淀剂的体积比为7:15-20。

58、第二方面，提供一种基于上述的替普瑞酮的检测方法的替普瑞酮的检测试剂盒，其特征在于：检测试剂盒包括替普瑞酮标准品、同位素内标标准品、沉淀剂和稀释剂。

59、本技术的有益效果在于：

60、本技术提供的替普瑞酮的检测方法开发出了采用含有甲醇和乙腈的沉淀剂对血浆样品进行蛋白沉淀前处理，乙腈具有蛋白沉淀的作用，甲醇含有羟基，替普瑞酮含有羰基，本技术实施例提供了一个可能的反应机理，甲醇的羟基可能与替普瑞酮的羰基反应，起到活化替普瑞酮的作用，显著提高替普瑞酮的检测灵敏度，处理过程简单、快速，待测物的损失率低，配合内标法进行检测，检测的准确度大幅提升，可以有效提高样品处理效率；与现有技术相比，本技术的检测方法采用蛋白沉淀法对样品进行前处理，不需要进行液液萃取，待测物损失率低，检测灵敏度高，可简单、快速、批量处理样品，提高了检测准确度以及检测效率；

61、本技术提供的替普瑞酮的检测试剂盒配备了替普瑞酮标准品、同位素内标标准品、沉淀剂和稀释剂，为采用内标法建立标准曲线以及检测提供了必要的化学物质，应用于检测生物样品中的替普瑞酮含量时，可根据检测的需要配制所需要的标准液浓度，建立合适范围的标准曲线，物品齐全，配制方便，灵活便捷，而且准确度高。