猫细小病毒检测试剂盒的制作方法

本发明涉及生物检测，具体涉及猫细小病毒检测试剂盒。

背景技术：

1、猫细小病毒，又称猫泛白细胞减少症病毒(feline panleukopenia virus，fpv)、猫瘟病毒，猫传染性肠炎病毒，属于细小病毒科，细小病毒属，是一种单链线状dna病毒。猫泛白细胞减少症病毒(fpv)引起的传染病以高热、呕吐、白细胞严重减少和肠炎为特征。

2、fpv不仅能引起猫、水貂明显的临床症状和很高的死亡率，而且能感染几乎所有的猫科动物。血清学调查结果表明，许多这类动物的血清中，含有抗本病毒的特异性抗体，表明在自然情况下病毒在这些动物间的广泛存在和传播。

3、猫泛白细胞减少症给宠物业造成巨大的损失。其主要侵害幼猫，潜伏期2～9天，平均4天。本病的临床表现甚为多样，分为特急性型、急性型、亚急性型和不显型。特急性型不待发现临床症状即突然死亡，畜主往往怀疑为中毒。急性型可于24小时内死亡。亚急性型可持续数日到一周，呈双相热。第一期发热时病畜体温升高40℃左右，持续约一天，发热平息后数天第二次发热，体温40℃以上，同时出现厌食、呕吐、沉郁、出血性肠炎和脱水等症状，病猫多于5～6天死亡，死亡率一般为60％～70％。在严重流行时幼猫几乎全部死亡。病程超过6天以上的猫，有可能经过较长时间的恢复期后痊愈。

4、猫泛白细胞减少症的治疗方法主要应用干扰素结合高免血清进行特异性治疗，同时配合对症治疗，就可以取得很好的治疗效果。因此，对于fpv的尽早诊断和检测，对于减少宠物业的损失，具有重要的意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供检测猫细小病毒检测试剂盒，该试剂盒基于双抗体夹心酶联免疫法设计，能够具有良好的灵敏性、特异性和稳定性。

2、本发明提供的猫细小病毒的检测试剂中包括捕获抗体和检测抗体。

3、其中，捕获抗体或检测抗体可以相同也可以不同。

4、所述捕获抗体：

5、(1)其轻链三个cdr区分别具有如seq id no:1～18中任一项所示的氨基酸序列；其重链三个cdr区分别具有如seq id no:19～36中任一项所示的氨基酸序列；

6、(2)与(1)所示的氨基酸序列中经过氨基酸的取代、添加或缺失一个或多个，但与(1)所示氨基酸功能相同或相似的氨基酸序列；或

7、(3)与(1)或(2)所示的氨基酸序列具备至少80％同源性的氨基酸序列。

8、所述捕获抗体：

9、ⅰ、其重链的四个fr区分别具有如seq id no:37～60中任一项所示的氨基酸序列；其轻链的四个fr分别具有如seq id no:61～84中任一项所示的氨基酸序列；

10、ⅱ、与ⅰ所示的氨基酸序列中经过氨基酸的取代、添加或缺失一个或多个，但与ⅰ所示氨基酸功能相同或相似的氨基酸序列；或

11、ⅲ、与ⅰ或ⅱ所示的氨基酸序列具备至少80％同源性的氨基酸序列。

12、所述检测抗体：

13、(1)其轻链三个cdr区分别具有如seq id no:1～18中任一项所示的氨基酸序列；其重链三个cdr区分别具有如seq id no:19～36中任一项所示的氨基酸序列；

14、(2)与(1)所示的氨基酸序列中经过氨基酸的取代、添加或缺失一个或多个，但与(1)所示氨基酸功能相同或相似的氨基酸序列；或

15、(3)与(1)或(2)所示的氨基酸序列具备至少80％同源性的氨基酸序列。

16、所述检测抗体：

17、ⅰ、其重链的四个fr区分别具有如seq id no:37～60中任一项所示的氨基酸序列；其轻链的四个fr分别具有如seq id no:61～84中任一项所示的氨基酸序列；

18、ⅱ、与ⅰ所示的氨基酸序列中经过氨基酸的取代、添加或缺失一个或多个，但与ⅰ所示氨基酸功能相同或相似的氨基酸序列；或

19、ⅲ、与ⅰ或ⅱ所示的氨基酸序列具备至少80％同源性的氨基酸序列。

20、本发明中，所述具有至少80％同源性的序列为在原序列的基础上，经取代、添加或缺失一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列中，所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个或36个。

21、一些实施例中，

22、所述检测抗体的轻链三个cdr区分别具有如seq id no:22～23中任一项所示的氨基酸序列；重链三个cdr区分别具有如seq id no:4～6中任一项所示的氨基酸序列；

23、所述捕获抗体的轻链三个cdr区分别具有如seq id no:24～26中任一项所示的氨基酸序列；重链三个cdr区分别具有如seq id no:7～9中任一项所示的氨基酸序列。

24、一些实施例中，

25、所述检测抗体重链的四个fr区分别具有如seq id no:41～44中任一项所示的氨基酸序列；轻链的四个fr分别具有如seq id no:65～68中任一项所示的氨基酸序列；

26、所述捕获抗体重链的四个fr区分别具有如seq id no:45～48中任一项所示的氨基酸序列；轻链的四个fr分别具有如seq id no:69～72中任一项所示的氨基酸序列；。

27、更具体的，

28、所述检测抗体重链可变区如seq id no:86所示，恒定区为iggh；轻链如seq idno:92所示，恒定区为κ型；

29、所述捕获抗体重链可变区如seq id no:87所示，恒定区为iggh；轻链如seq idno:93所示，恒定区为κ型。

30、一些实施例中，所述检测抗体或捕获抗体的重链和轻链的连接肽linker具有如seq id no:97所示的氨基酸序列。

31、一些实施例中，所述猫泛白细胞减少症病毒的抗体还包括恒定区，所述重链的恒定区为iggh，所述轻链的恒定区为κ链。

32、本发明中，所述捕获抗体包被于固相介质，所述检测抗体标记有化学标记或生物标记。

33、所述化学标记为同位素、免疫毒素和/或化学药物；所述生物标记为生物素、亲和素或酶标记。所述酶标记优选为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。所述免疫毒素优选为黄曲霉毒素、白喉毒素、绿脓杆菌外毒素、蓖麻毒蛋白、相思子毒蛋白、槲寄生凝集素、蒴莲根毒素、pap、造草素、白树毒素或丝瓜毒素。

34、所述固相介质或半固体介质是指本发明所述的重组抗体、经标记的重组抗体能够附着至其上的任何支持物，包括但不限于硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯(pvdf)膜、ipdms芯片、微孔板、聚苯乙烯平板、微粒、微载体、凝胶等。

35、所述捕获抗体包被于酶标板，所述检测抗体标记有hrp。

36、本发明所述的检测试剂中，还包括包被缓冲液、洗涤液、封闭液、tmb显色液和终止液；其中：

37、所述包被缓冲液为ph7.2～7.4的pbs缓冲液；

38、所述洗涤液为含有质量分数0.05％tween-20的pbst溶液；

39、所述封闭液为质量分数为2％的脱脂奶粉溶液；

40、所述终止液为2mol/l h2so4溶液。

41、进一步的，本发明还提供了猫细小病毒的检测方法，其包括以如前所述的检测试剂对样品进行检测。

42、本发明所述的检测方法可以是诊断目的的，也可以是非诊断目的的，本发明对此不做限定。其中，以诊断为目的的检测方法中，样品来自于动物体，非诊断目的的检测方法中，样品来自于环境，例如食物、水、实验室培养物或者器物表面的拭子等。

43、所述检测的方法包括：以捕获抗体对样品进行捕获后，加入检测抗体进行孵育，所述捕获抗体与检测抗体的质量比为10:1。

44、本发明中，所述捕获抗体包被在elisa板上，包被的浓度为2.5μg/ml，包被的条件为4℃孵育12小时。所述包被后以bsa封闭，封闭的条件为37℃孵育120min。

45、本发明中，所述捕获的条件为37℃，1h；所述孵育的条件为37℃，1h。

46、本发明中，所述孵育后，还包括tmb显色、终止显色和读取450nm吸光度的步骤。

47、本发明所述的检测方法可以为定性检测的方法。

48、所述定性检测根据是否产生荧光判断结果，产生荧光的样品为阳性样品。

49、本发明提供了双抗体夹心酶联免疫法的检测猫泛白细胞减少症病毒的试剂。本发明通过构建噬菌体展示文库筛选出猫泛白细胞减少症病毒的特异性抗体，并将其用于fpv的检测，具有特异性高、灵敏度高和稳定性好等优势。