一种快速联检吡虫啉和多菌灵的竞争型荧光免疫层析试纸条、荧光探针及应用

本发明属于农药残留检测，具体涉及一种快速联检吡虫啉和多菌灵的竞争型荧光免疫层析试纸条、荧光探针及应用。

背景技术：

1、食品安全一直是人们关注的首要问题，随着近年来农业生产的发展，农药的广泛使用导致了农药残留问题日益突出。吡虫啉(imidacloprid，imi)和多菌灵(carbendazim，cbz)作为农业上常见的杀虫剂、杀菌剂，通过抑制细菌或真菌的生长和繁殖来保护作物生长，提高产量。研究表明，长期接触imi和cbz等农药可导致抑郁症、神经系统缺陷、糖尿病和鼻炎等慢性疾病，在某些情况下还会导致肝损伤、癌症和对胎儿造成影响导致异常出生。由于农药残留的危害，欧盟设定了最低的监管下限，imi为0.01mg/kg，cbz为0.01mg/kg，美国规定的监管下限imi为0.05mg/kg,cbz为0.1mg/kg。

2、目前常用的农药残留检测方法主要是基于色谱、质谱和其他仪器分析技术，如气相色谱、液相色谱-质谱和高效液相色谱。这些方法灵敏度高、准确度高，但耗时长、成本高，需要专业技术人员操作，且不能同时分析多个目标分析物，限制了检测的范围和效率。侧流分析法(lateral flow assay,lfa)具有快速、低成本、简单的特点，是一种成熟的poct(point-of-care testing)免疫分析技术，已广泛用于农药残留、毒素、病毒、抗生素等各种分析物的检测。传统的lfa通常使用胶体金(aunps)标记抗体作为标签与目标分子结合，根据比色信号的变化检测目标分子，但该方法灵敏度低、定量能力弱、多路检测能力差。

3、sio2纳米球是一种低成本的单分散纳米颗粒，由于其在复杂样品中分散性好、稳定性好、背景低、制备简单等优点，被用作构建lfa应用的高性能荧光纳米标签的合适载体。许多小量子点可以很容易地包覆在sio2表面或嵌入到sio2的介孔中，从而提供比单一量子点材料更强的荧光特性。最近，已经开发出多种基于sio2的量子点材料，包括sio2@qd、树枝状介孔sio2-qds、sio2@au@qd等，并作为lfa法的荧光标签，用于高灵敏检测病毒、细菌、免疫球蛋白和蛋白质生物标志物等生物大分子。然而，目前还没有基于sio2-qd的荧光lfa用于小分子污染物检测的报道。

4、公布号为cn107063798a的中国专利申请文献，公开了一种用于蔬菜中农药残留的检测方法，该专利的检测方法，包括以下步骤：s1、选取检测蔬菜、水果样品，经缩分后，将其切碎，放入食品料理机中粉碎，制成待测样品；s2、称取35g待测样于150ml烧杯中，加入70ml乙腈，用匀浆机高速匀浆2-5分钟后用滤纸过滤；s3、将s2得到的滤液加入到装有氯化钠的150ml具塞量筒中，收集滤液60-80ml后盖上塞子，剧烈震荡1分钟，在室温下静置30分钟，使乙腈与水相分层；s4、在s3具塞量筒中吸取15ml溶液放入50ml烧杯中，将烧杯放在水浴锅上加热，烧杯中缓慢通入空气流，蒸发近干，加入3ml甲醇加二氯甲烷，溶解残渣，盖上铝箔，得到净化液；s5、将氨基柱依次用4ml甲醇加二氯甲烷预淋洗条件化，倒入s4得到的净化液，用15ml刻度离心管接收洗脱液，用2ml甲醇加二氯甲烷冲洗烧杯后过氨基柱，并重复1次，将有淋洗液的刻度离心管置于水温50℃的氮吹仪上，氮吹蒸发近干，用甲醇定容至5ml，在旋涡器上混匀，用滤膜过滤，移入紫外检测器进行检测分析。具有高效、准确、灵敏且操作重现性好的特点，既满足了检测工作的需要，又提高了检测效率。但该专利的检测方法操作步骤复杂，且灵敏度不高。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于如何解决现有的农药残留检测方法所存在的灵敏度低、定量能力弱、多路检测能力差的问题。

2、本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：

3、本发明的第一方面提出一种快速联检吡虫啉和多菌灵的竞争型荧光免疫层析试纸条，其由样品垫、硝酸纤维素(nc)膜、吸水垫依次粘贴在聚氯乙烯(pvc)底板上组成；所述硝酸纤维素(nc)膜在吸水垫向样品垫方向依次设有质控线c、检测线t1和检测线t2；所述质控线包被有羊抗鼠igg抗体；所述检测线t1包被有吡虫啉半抗原(imi-bsa)；所述检测线t2包被有多菌灵半抗原(cbz-bsa)。

4、有益效果：本发明利用所述竞争型荧光免疫层析试纸条同时检测吡虫啉和多菌灵，具有高灵敏、定量、稳定和操作简单的特点，在复杂食品中的应用具有良好的准确性、特异性和稳定性。

5、优选的，所述羊抗鼠igg抗体的浓度为0.06～0.1mg/ml。

6、优选的，所述羊抗鼠igg抗体的浓度为0.08mg/ml。

7、优选的，所述吡虫啉半抗原(imi-bsa)的浓度为0.1～0.3mg/ml。

8、优选的，所述吡虫啉半抗原(imi-bsa)的浓度为0.2mg/ml

9、优选的，所述多菌灵半抗原(cbz-bsa)的浓度为0.3～0.5mg/ml。

10、优选的，所述多菌灵半抗原(cbz-bsa)的浓度为0.4mg/ml。

11、本发明的第二方面提出一种吡虫啉和多菌灵的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

12、(1)硅核多层量子点的制备：

13、s1：采用改进的化学沉淀法制备粒径为180～220nm的纳米sio2颗粒；

14、s2：向步骤s1制得的纳米sio2颗粒的水溶液中加入聚乙烯亚胺(pei)溶液，超声处理，离心，清洗，重悬在去离子水中，得到pei包覆sio2颗粒的水溶液(sio2-pei)；

15、说明：带正电荷的pei通过静电吸附作用自组装在带负电荷的sio2颗粒表面。

16、s3：向sio2-pei水溶液中加入红色量子点(cdse/zns-mpa qds)，超声处理，离心，清洗，重悬在无水乙醇溶液中，得到硅核单层量子点复合纳米颗粒(sio2-qbs)；

17、说明：带负电荷的量子点静电吸附在正电性的sio2-pei颗粒上。

18、s4：将sio2-qbs颗粒继续重复步骤s2和s3，制备出硅核多层量子点复合纳米颗粒(silica–core multilayered quantum dot nanobeads，sio2-mqbs)；

19、(2)sio2-mqb偶联农药抗体：

20、s5：将步骤s4得到的sio2-mqbs溶液离心，弃去上清，沉淀物用2-吗啉乙磺酸(mes)缓冲液复溶，超声分散；加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)水溶液和n-羟基硫代琥珀酰亚胺(nhs)水溶液，超声处理，得到羧基活化的sio2-mqbs；

21、s6：离心去除过量的edc和nhs，将沉淀物重悬在含有吐温-20的pbs缓冲液中，加入吡虫啉和多菌灵单克隆抗体，涡旋混合均匀，放置在恒温振荡仪上室温孵育后，加入牛血清白蛋白水溶液封闭未结合的羧基位点；

22、s7：离心，用含有吐温-20的pbs缓冲液洗涤，将沉淀物复溶在含有吐温-20的pbs缓冲液中，即得吡虫啉和多菌灵的荧光探针。

23、本发明的第三方面提出采用上述制备方法制得的荧光探针。

24、本发明的第四方面提出上述的竞争型荧光免疫层析试纸和/或上述荧光探针在食品中吡虫啉和多菌灵残留检测中的应用。

25、本发明的第五方面提出一种快速联检吡虫啉和多菌灵残留的方法，包括以下步骤：

26、1)制备待测食品样品液：

27、将食品样本捣碎，称取食品样品于离心管中；加入含有甲醇和磷酸盐缓冲液(pbs)的提取液，充分振荡后，超声混匀；静置后，使用mce水系针头过滤器收集食品样品上清液，用含有吐温-20的pbs缓冲液稀释，制得待测食品样品液；

28、2)对待测食品样品液进行检测：取待测食品样品液，加入上述吡虫啉和多菌灵的荧光探针，涡旋混合均匀；将上述竞争型荧光免疫层析试纸条样品垫朝下插入混合溶液中，室温开始色谱反应，在紫外灯照下肉眼观察试纸条荧光强度，对检测结果进行定性分析；

29、3)当待测食品样品液中含有一定浓度目标物(即吡虫啉、多菌灵)时，检测线t1和t2不显示荧光，质控线c显示红色荧光，即结果为阳性；当待测样品液中无目标物存在时，检测线t1和t2和质控线c均显示红色荧光，即结果为阴性；使用荧光读取仪读取检测线t1和t2的荧光强度值，将平均荧光信号带入建立的浓度与荧光强度的标准曲线中，即得残留的吡虫啉和多菌灵的浓度。

30、优选的，所述步骤3)中平均荧光信号为每个样本重复三次并测量的荧光信号平均值；所述标准曲线的建立具体为根据测定吡虫啉和多菌灵三倍稀释浓度下的农药标准品，测量检测线上的荧光信号值，建立浓度与荧光强度的标准曲线。

31、优选的，所述步骤3)吡虫啉和多菌灵的检测限分别为吡虫啉：1.94pg/ml、多菌灵：14.79pg/ml。

32、本发明的优点在于：

33、1、本发明提供一种同时快速联合检测两种小分子物质的竞争型免疫层析方法，以硅核多层量子点纳米球(sio2-mqb)为液体荧光探针，建立了直接、超灵敏、定量检测复杂食品样品中常见的两种农药吡虫啉和多菌灵的竞争型荧光免疫层析试纸条。

34、2、本发明的sio2-mqb纳米结构包含一个200nm的sio2核和大量羧基化qds形成的壳，与传统荧光微球相比具有更好的稳定性、更优越的分散性和更高的发光性能，大大提高了lfa方法对农药检测的灵敏度。

35、3、本发明直接使用液体sio2-mqb标签代替传统的共轭衬垫，不仅简化了lfa体系的结构，而且提高了纳米标签与靶点的免疫结合反应效率。