一种地黄丸类方制剂中熟地黄质量控制的方法与流程

本发明涉及中药制剂的质量控制，具体涉及一种地黄丸类方制剂中熟地黄质量控制的方法。

背景技术：

1、熟地黄被称为“至阴之药”，是玄参科植物地黄rehmanniaglutinosa块根的加工炮制品，是中药“滋阴”作用最具代表的药味之一，配伍后相关方剂可应用于肝肾阴虚导致的多种临床疾病：如2型糖尿病、糖尿病肾病和胰岛素抵抗等糖尿病相关疾病，阿尔茨海默病、帕金森和血管性痴呆等神经系统疾病，类风湿等骨关节炎相关疾病以及妇科绝经后骨质疏松、肾阴虚型月经过少、卵巢早衰继发性闭经、围绝经期综合征、更年期综合征等等。

2、化学成分研究表明，熟地黄中主要含有益母草苷、桃叶珊瑚苷、梓醇、京尼平苷、地黄苷a、地黄苷b、地黄苷c、地黄苷d、地黄素a、地黄素c、地黄素d、密力特苷等环烯醚萜类；地黄紫罗兰苷a、地黄紫罗兰苷b、野菰酸、地黄苦苷等紫罗兰酮类；以及松果菊苷、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷a1、异毛蕊花糖苷、地黄苷、洋地黄叶苷c、对羟基苯乙醇等苯乙醇类化合物；此外还包括糖类、核苷类、生物碱类、酚酸类、异黄酮苷类以及其他类化合物。我们曾以梓醇、地黄苷a、地黄苷d、益母草苷和毛蕊花糖苷5种地黄成分灌胃阴虚模型大鼠，发现能够显著降低血清中t3、t4及血浆中camp含量及camp/cgmp比值，结果提示以上成分可能是熟地黄滋阴清热作用的主要药效物质基础。

3、遵循安全有效、技术先进和经济合理的原则，熟地黄药材药典标准的建立也是一个动态、逐步完善的过程：2010年版一部相比2005年版删除了以5-羟甲基糠醛指标成分为对照的薄层【鉴别】项，新增了毛蕊花糖苷(c29h36o15)成分的薄层【鉴别】和【含量测定】项；而2020年药典又删除了毛蕊花糖苷的含量要求，新增地黄苷d(c27h42o20)含量不得少于0.050％的规定，为我国药品研制、生产、经营、使用和监督管理均应遵循的标准提供了法定依据，提高了药材饮片质量控制水平。

4、地黄丸类方是以熟地黄为主药，以滋补肾精、调补肾中阴阳为基本功效的一组方药。其中滋补肾阴的代表方六味地黄丸出自北宋太医钱乙《小儿药证直诀》，由《金匮》肾气丸去附子、桂枝，易干地黄为熟地黄而成，清《医宗金鉴》将六味地黄丸增加知母、黄柏而成知柏地黄丸主治肾阴不足所致阴虚火旺诸症，而后世的杞菊地黄丸兼能养肝明目、归芍地黄丸偏于养血调经、麦味地黄丸润肺益气…以上地黄丸类方制剂均为历代药典收载品种，其处方共性是在六味地黄丸基础上加味而成，制法、规格和用量类似，形成了中成药市场上一个大的品类。

5、2020年版《中国药典》一部成方制剂收载了六味地黄大蜜丸、水蜜丸、浓缩丸、胶囊和软胶囊等制剂标准，测定莫诺苷、马钱苷、丹皮酚3个指标对处方药味山茱萸和牡丹皮进行质量控制。近年来有关于六味地黄膏中毛蕊花糖苷的hplc含量测定，以及杞菊地黄丸中毛蕊花糖苷及另外10个成分同时测定的hplc-ms/m联用方法，但毛蕊花糖苷成分已经不是现行药典熟地黄法定含量指标，而三重四级杆串联质谱检测器的配置过高不利于技术的普及和推广，对整个地黄丸类方制剂的适用性也未见提及。麦味地黄丸近年来的质量研究文献主要是对其制剂中五味子醇甲的含量控制。归芍地黄丸未检索到相关报道，药典标准是以芍药苷(c23h28o11)计其蜜丸制剂中所含白芍、牡丹皮，以莫诺苷(c17h26o11)和马钱苷(c17h26o10)的总量计山茱萸，以丹皮酚(c9h10o3)计牡丹皮。知柏地黄丸现行药典标准的鉴别项除了对相关药味的粉末显微鉴别外，以丹皮酚、盐酸小檗碱对照品和黄柏对照药材鉴别了制剂中牡丹皮和黄柏药味，规定了马钱苷(c17h26o10)、丹皮酚(c9h10o3)的含量标准，而制剂中菝葜皂苷元、毛蕊花糖苷的含量测定近年来也有文献报道。现行标准和文献未见桂附地黄丸熟地黄定性定量方法。

6、综上所述，熟地黄作为地黄丸类方制剂的君药或者重用药味，虽然处方药量占比超过1/4甚至1/3之多，但是由于复方中药成分的复杂性，目前针对“地黄”控制的药典收载标准和文献研究较少，尤其是与熟地黄饮片法定标准相对应的毛蕊花糖苷定性鉴别和地黄苷d定量测定方法，缺少对多种地黄丸制剂普遍适用的快速检测技术。

技术实现思路

1、为解决方中君药熟地黄的量化控制不足的技术问题，本发明提供了一种含熟地黄的产品中熟地黄质量控制的方法。

2、一种地黄丸类方制剂中熟地黄质量控制的方法，包括以下步骤：

3、(1)样品预处理：对待测地黄丸类方制剂进行预处理一得到待测样品溶液一，对待测地黄丸类方制剂进行预处理二得到待测样品溶液二；

4、所述预处理一为：依次使用甲醇、水饱和正丁醇进行提取，提取后通过含sp700型大孔吸附树脂的混合柱，依次使用水、甲醇洗脱，残渣加水溶解后通过固相萃取柱，收集流出液，蒸干，残渣用甲醇溶解；

5、所述预处理二为：使用甲醇进行提取，冷却后用50％甲醇补足减失的重量，再通过含sp700型大孔吸附树脂的混合柱，依次使用水、甲醇洗脱，浓缩，残渣用甲醇溶解；

6、(2)用毛蕊花糖苷对照品、熟地黄对照药材、待测样品溶液一以薄层色谱法对毛蕊花糖苷成分定性鉴别；

7、(3)采用高效液相色谱法对待测溶液二中地黄苷d成分定量测定。

8、优选的，步骤(1)中，所述预处理一的方法为取折合熟地黄生药量0.5～1.0g的待测地黄丸类方制剂样品，加入60～100％甲醇，密塞，溶散，提取0.5～1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取2～4次，合并得到正丁醇液，将正丁醇液蒸干，残渣加水使溶解，通过混合柱，用水洗脱，再用30％甲醇洗脱，再用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，减压回收溶剂，残渣加水溶解后通过固相萃取柱，收集流出液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，得到待测样品溶液一。

9、优选的，取折合熟地黄生药量0.5～1.0g的待测地黄丸类方制剂样品，加入60～100％甲醇50～100ml，密塞，振荡涡旋使溶散，超声提取0.5～1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取2～4次，每次10ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加水10ml使溶解，通过sp700型大孔吸附树脂柱，用水80ml洗脱，弃去，再用30％甲醇50～100ml洗脱，弃去，续用甲醇100～200ml洗脱，收集甲醇洗脱液，减压回收溶剂，残渣加10ml水溶解后通过c18固相萃取柱，收集流出液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，得到待测样品溶液一。

10、优选的，步骤(1)中，所述预处理二的方法为取折合熟地黄生药量0.5～1.0g的待测地黄丸类方制剂样品，加入50％甲醇，密塞，称定重量，提取0.5～1小时，冷却后再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，减压回收溶剂近干，残渣用水溶解，定量转移通过混合柱，用水洗脱，弃去水液，再用30％甲醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，残渣用30～70％甲醇溶解滤过，得到待测样品溶液二。

11、优选的，取折合熟地黄生药量0.5g～1.0g的待测地黄丸类方制剂样品，加入50％甲醇100ml，密塞，称定重量，振荡涡旋使溶散，超声提取0.5～1小时，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液50ml，减压回收溶剂，残渣用水10ml分次溶解，定量转移通过sp700型大孔吸附树脂柱，用水80ml洗脱，弃去水液，再用30％甲醇50～150ml洗脱，收集洗脱液，浓缩，残渣用50％甲醇溶解并定容至2ml量瓶，摇匀，滤过，得到待测样品溶液二。

12、优选的，所述混合柱的柱内径为0.8～1.2cm，柱高为10～25cm，柱内混合填料体积比或质量比为硅藻土：d101型大孔吸附树脂：sp700型大孔吸附树脂＝0～2：0～3：2～7份。

13、优选的，步骤(2)中将待测样品溶液一、毛蕊花糖苷对照品和熟地黄对照药材溶液分别点于同一聚酰胺薄膜板上，以甲醇-冰乙酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下，在365nm波长下检视待测样品色谱中在与对照品、对照药材色谱相应位置上是否具有相同颜色的荧光斑点；

14、展开剂中甲醇：冰乙酸：水的体积比为3：1：7。

15、优选的，步骤(3)中色谱条件为：色谱柱为agilent zorbax sb-c18，流动相a为乙腈或者甲醇，流动相b为0.1％磷酸水溶液或者0.1％甲酸水溶液，a：b＝1～10％，体积流量为1ml·min-1，检测波长为203nm，理论板数按地黄苷d峰计算应不低于5000。

16、优选的，所述六味地黄丸类方制剂为六味地黄丸、麦味地黄丸、桂附地黄丸、知柏地黄丸、杞菊地黄丸、归芍地黄丸。

17、优选的，所述六味地黄丸类方制剂剂型为大蜜丸、小蜜丸、水丸、水蜜丸、浓缩丸、口服液、散剂、颗粒剂、胶囊剂和软胶囊剂。

18、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

19、1、六味地黄丸系列制剂是现阶段我国临床常用中成药中一个很大的品类，但限于方中君药熟地黄的量化控制不足，本发明创建熟地黄制剂标准应用技术平台，采用薄层色谱法对毛蕊花糖苷成分进行定性鉴别，对地黄苷d的含量进行定量测定，开发其产品线通用、快速、简易检测方法，是对已有质量控制研究体系的进一步完善。

20、2、本发明能够同时开展多种地黄丸类方制剂中熟地黄定性定量，大大降低了药品检测时间成本；同时不同厂家、品种、批次样品溶液的平行制备和结果呈现，适合生产企业品控的快速在线检测和药检部门对地黄丸系列产品的优质性评价，对品质提升和工艺改进具有积极意义。