一种多肽药物特利加压素和特定杂质的高效液相色谱分析方法与流程

本发明涉及多肽药物分析检测，尤其涉及一种多肽药物特利加压素和特定杂质的高效液相色谱分析方法。

背景技术：

1、特利加压素(terlipressin)化学名为n-α-三甘氨酰-8-赖氨酸-加压素，是一种人工合成的多肽类化合物，主要用于治疗胃肠道出血、泌尿生殖系统出血、术后出血及肝肾综合征等。由于特利加压素临床上多以注射剂型使用，因此，对特利加压素的纯度要求非常高，如何快速、高效地分离分析特利加压素的杂质对质量控制是非常必要的。

2、δava10-特利加压素为特利加压素制备过程中产生的一种工艺杂质，在文献cn105301156b中有所提及，然而该文献中特利加压素的保留时间约为15.695min，δava10-特利加压素的保留时间约为16.107min，保留时间差异不到0.5min，无法达到药典分析方法中分离度r≥1.5的要求。此外，采用醋酸特利加压素（2015版药典征求意见稿）、药典ep9.8和药典bp2019和现有技术的其它方法均无法将δava10-特利加压素杂质进行有效分离。因此，提供一种能够快速分离并有效检出特利加压素及δava10-特利加压素杂质的方法具有重要意义。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明提供一种多肽药物特利加压素和特定杂质的高效液相色谱分析方法，能够将特利加压素和δava10-特利加压素杂质进行快速、准确的定量分析，从而保证特利加压素及其制剂的质量可控性。

2、为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明提供一种多肽药物特利加压素和特定杂质的高效液相色谱分析方法，所述杂质为δava10特利加压素；所述方法的色谱条件为：反相液相色谱柱的填料为苯基硅烷键合硅胶，洗脱方式为梯度洗脱，柱温为40℃~45℃，梯度斜率为0.5，流动相由流动相a和流动相b组成，其中，流动相a为缓冲盐水溶液，流动相b为有机溶剂。

4、本发明提供的方法中，发明人约定梯度斜率为有效洗脱分离、在色谱图上展开各组分的时间内，流动相b的比例变化值与时间的比值（即每分钟流动相b体积提升的百分比）。

5、在大量的实验和研究过程中，发明人偶然发现在特定时间内，以苯基硅烷键合硅胶为色谱柱填料，并控制梯度斜率为0.5，可以有效分离特利加压素和δava10特利加压素杂质。发明人也尝试过控制该比值为其他数值，如0.125、0.25等，或采用其他填料的色谱柱，但各峰之间存在重合、包覆或者峰型不佳的现象，不利于杂质的定性及定量检测。此外，本发明通过将柱温控制为40℃~45℃，有利于实现各成分峰分离，过低的柱温会严重影响柱效，而过高的柱温则会损坏色谱柱。

6、进一步的，所述流动相a为磷酸二氢铵水溶液、硫酸铵水溶液或硫酸钠水溶液中的至少一种。

7、进一步的，所述流动相a的浓度为10mmol/l~200mmol/l，ph值为3.0。

8、需要说明的是，本发明中磷酸二氢铵水溶液需用磷酸调节ph至3.00，硫酸铵水溶液需用硫酸调节ph至3.00，硫酸钠水溶液需用硫酸调节ph至3.00。

9、当流动相a的浓度为10mmol/l~200mmol/l，ph值为3时，分离效果较好，峰型较好且对称，拖尾较轻，与本发明其他色谱条件诸如色谱柱、流动相的选择、流速等相结合，整体分离度较好；而流动相a浓度及ph不在该范围内时，拖尾现象愈发明显，无法实现有效分离进而无法定量分析检测δava10特利加压素这一特定杂质。

10、进一步的，所述流动相b为甲醇。

11、进一步的，所述梯度洗脱的流速为1.0ml/min~1.2ml/min。

12、本发明通过将流动相的流速控制在1.0ml/min~1.2ml/min，能够兼顾检测效率和分离度，有利于实现最佳检测效果。流速过高会加快洗脱速度，缩短出峰时间，不利于实现分离效果，而过低的流速则会降低洗脱速度，在出峰时间延迟的同时也会拉宽各组分峰宽，同样不利于实现分离效果，也降低了检测效率。

13、进一步的，所述梯度洗脱的程序为：

14、表1

15、

16、需要说明的是，在有效的梯度洗脱的时间内，即如上表所述的0~40min，按照15%~35%有机相（即流动相b）的比例进行梯度洗脱，样品的各组分在色谱图上展开成色谱峰。按现有公知技术，在保持梯度斜率为0.5的前提下，可对有效梯度洗脱的持续时间和有机相的初始梯度做相应的调整，但通常不影响其分离效果。在梯度冲柱的时间内，如上表所述的40min~45min，按照80%有机相的比例梯度冲柱，使色谱柱恢复到正常或空白状态，按现有公知技术，可对梯度冲柱的持续时间和有机相的比例或冲柱梯度斜率做相应的调整。在等度平衡的时间内，如上表所述45.1min~55min，按照15%有机相的比例平衡，为下次分析进样做准备，按现有公知技术，可对等度平衡的有机相比例或持续时间做相应的调整。

17、优选的，本发明所用反相色谱柱中苯基硅烷键合硅胶填料粒径为5μm，孔径为100å，色谱柱直径为4.6mm，柱长为250mm。需要说明的是，按现有公知技术，选用的苯基柱应包括但不限于其它能达到分析检测要求的品牌或型号，例如可选用岛津苯基柱，填料粒径为3μm，色谱柱直径为4.6mm，柱长为150mm。

18、优选的，所述液相色谱柱型号为ultimate xb-phenyl，规格为4.6mm×250mm，5μm。

19、相对于现有技术，本发明提供的方法通过选择特定填料的色谱柱、流动相以及梯度洗脱条件等，能够将特利加压素与δava10特利加压素杂质进行有效分离，且分离度≥1.5，专属性好，灵敏度高，可用于δava10特利加压素的定量分析检测，从而保证特利加压素及其制剂的质量可控性。

技术特征：

1.一种多肽药物特利加压素和特定杂质的高效液相色谱分析方法，其特征在于，所述杂质为δava10特利加压素；所述方法的色谱条件为：反相液相色谱柱的填料为苯基硅烷键合硅胶，洗脱方式为梯度洗脱，柱温为40℃~45℃，梯度斜率为0.5，流动相由流动相a和流动相b组成，其中，流动相a为缓冲盐水溶液，流动相b为有机溶剂。

2.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述流动相a为磷酸二氢铵水溶液、硫酸铵水溶液或硫酸钠水溶液中的至少一种。

3.如权利要求2所述的分析方法，其特征在于，所述流动相a的浓度为10mmol/l~200mmol/l，ph值为3.0。

4.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述流动相b为甲醇。

5.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述梯度洗脱的流速为1.0ml/min~1.2ml/min。

6.如权利要求1~5任一项所述的分析方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序为：

技术总结
本发明涉及多肽药物分析检测技术领域，具体公开一种多肽药物特利加压素和特定杂质的高效液相色谱分析方法。所述方法的色谱条件为：反相液相色谱柱的填料为苯基硅烷键合硅胶，洗脱方式为梯度洗脱，柱温为40℃~45℃，梯度斜率为0.5，流动相由流动相A和流动相B组成，其中，流动相A为缓冲盐水溶液，流动相B为有机溶剂。本发明通过选择特定的色谱柱、流动相以及洗脱条件等，能够将特利加压素与δAva10特利加压素杂质进行有效分离，且分离度≥1.5，专属性好，灵敏度高，可用于δAva10特利加压素的定量分析检测，从而保证特利加压素及其制剂的质量可控性。

技术研发人员：邓仲敏,张丽丽,侯吉昊,蔡松亚,丁伟,胡亚南,程安怡
受保护的技术使用者：南京知和医药科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15