一种荧光偶极子三维取向解析成像系统及其方法

本发明涉及荧光分子解析技术，具体涉及一种荧光偶极子三维取向解析成像系统及其方法。

背景技术：

1、荧光分子不是各向同性源，并表现出偶极子行为，在吸收和或发射过程中表现为振荡电偶极子。在这些过程中，电磁场的极化状态是至关重要的，因为它与分子取向有关，并提供了对耦合特性的见解。传统的荧光偏振显微镜(fluorescence polarizationmicroscopy，fpm)可以通过偏振激发(线性二色性)或偏振检测(荧光各向异性)可以来测量荧光偶极子取向。fpm在研究分子排列和脂质膜的生物学机制方面被证明是有价值的。然而，基于偏振研究的传统荧光显微镜由于光学衍射而面临局限性。

2、为了解决这个问题，已经开发了两种超分辨率fpm技术:单分子定位显微镜(single-molecule localization microscopy，smlm)和偏振解调技术。虽然smlm提供了高空间分辨率，但它牺牲了时间分辨率，并且需要专门的样品制备，限制了其对动态细胞过程的适用性。另一方面，偏振解调技术，如超分辨率偏振解调(super-resolution bypolarization demodulation，spod)和超分辨率偶极取向映射(super-resolution dipoleorientation mapping，sdom)，提供了快速的成像速度和与传统荧光标记的兼容性。然而，这些技术缺乏完全捕获荧光偶极子的三维方向的能力。sdom的引入是为了解决spod中丢失方向信息的限制，但它仅限于二维方向的确定。

3、在二维取向求解中，由于求解的是样品在样本面的投影因而会引起角度求解的偏差，并且二维取向求解中采用的投影结果无法反映样品垂直于样本平面的情况，三维取向映射可以解决这一问题，使三维生物样品的亚细胞结构得到全面的空间理解。然而，在不进行复杂的样品处理的情况下，基于偏振调制技术实现三维方向是相当具有挑战性的。

技术实现思路

1、针对以上现有技术存在的问题，本发明提出了一种荧光偶极子三维取向解析成像系统及其方法。

2、本发明的一个目的在于提出一种偶极子三维取向解析成像系统。

3、本发明的荧光偶极子三维取向解析成像系统包括：激光光源、第一至第三半波片、偏振分束器、空间光调制器、第一至第三透镜、准直扩束元件、掩膜、二向色镜、物镜和探测器；其中，激光光源发出的激光经过单模保偏光纤变成线偏振光；线偏振光经过第一透镜实现准直平行；平行光经过第一半波片调节偏转角度，经偏振分束器入射到空间光调制器，生成具有不同级次的衍射光；在空间光调制器上加载设定频率和方向的黑白相间条纹，从而调节从空间光调制器出射的衍射光的方向；衍射光经第二半波片改变偏振方向，经偏振分束器至第二透镜；第二透镜使得衍射光会聚至第三半波片；第三半波片将不同级次的衍射光的偏振方向调整为p偏振，再经过掩膜后仅透过+1或-1级的衍射光；+1或-1级的衍射光经过准直扩束元件准直并会聚后，经过二向色镜垂直入射到物镜且入射位置不位于物镜后焦面的中心，即+1或-1级的衍射光不位于物镜的光轴上，使得+1或-1级的衍射光经过物镜后，从物镜倾斜出射激发光，倾斜入射至样品；在样品上设置有荧光探针进行标记，荧光探针作为荧光偶极子；倾斜入射至样品的激发光激发荧光探针产生发射荧光，发射荧光经二向色镜和第三透镜后被探测器接收，生成荧光图像，探测器与空间光调制器的调制频率同步；

4、在空间光调制器加载的条纹方向改变从物镜倾斜出射激发光在样品平面的投影与x轴之间的夹角，x轴为样品平面的水平方向，加载的条纹频率改变倾斜出射的激发光相对于物镜光轴的夹角值，以物镜光轴为z轴；利用在空间光调制器上分别加载方向不同的n次条纹，n≥2，其中条纹的方向分别依次相差2π/n，从物镜出射的第n个倾斜光与x轴之间的夹角为αn＝α0+2π(n-1)/n，n＝1,…,n，其中α0为第一个倾斜出射的激发光与x轴之间的夹角；空间光调制器上加载的第n次条纹的频率为fn，第n个倾斜出射的激发光与物镜光轴之间的夹角为βn；入射到样品的激发光的偏振态与传输方向有关，激发光的传输方向改变，偏振态相应发生改变；空间光调制器加载设定的不同方向的条纹，会使得从物镜分别出射n个不同角度的倾斜出射的激发光，激发光的传输方向的变化使得对应从物镜倾斜出射的激发光的偏振态改变，该过程称为偏振激发调制，n次偏振激发调制为一个调制周期；从物镜倾斜出射的激发光的偏振态的改变，使得荧光偶极子的激发效率发射改变，对应的发射荧光强度也发生改变；利用探测器采集得到荧光图像，通过构建荧光偶极子对于偏振激发调制的响应模型并提取角度信息，得到荧光偶极子的三维取向信息。

5、准直扩束元件包括第四透镜和第五透镜，经第四透镜准直并经第五透镜会聚。β1～βn不限定角度。

6、空间光调制器采用光栅、液晶空间光调制器(slm)、数字微镜器件(dmd)或振镜。

7、本发明的另一个目的在于提出一种荧光偶极子三维取向解析方法。

8、本发明的荧光偶极子三维取向解析方法，包括以下步骤：

9、1)搭建荧光偶极子三维取向解析成像系统：

10、激光光源发出的激光经过单模保偏光纤变成线偏振光；线偏振光经过第一透镜实现准直平行；平行光经过第一半波片调节偏转角度，经偏振分束器入射到空间光调制器，生成具有不同级次的衍射光；在空间光调制器上加载设定频率和方向的黑白相间条纹，从而调节从空间光调制器出射的衍射光的方向；衍射光经第二半波片改变偏振方向，经偏振分束器至第二透镜；第二透镜使得衍射光会聚至第三半波片；第三半波片将不同级次的衍射光的偏振方向调整为p偏振，再经过掩膜后仅透过+1或-1级的衍射光；+1或-1级的衍射光经过准直扩束元件准直并会聚后，经过二向色镜垂直入射到物镜且入射位置不位于物镜后焦面的中心，即+1或-1级的衍射光不位于物镜的光轴上，使得+1或-1级的衍射光经过物镜后，从物镜倾斜出射激发光，倾斜入射至样品；在样品上设置有荧光探针进行标记，荧光探针作为荧光偶极子；倾斜入射至样品的激发光激发荧光探针产生发射荧光，发射荧光经二向色镜和第三透镜后被探测器接收，生成荧光图像，探测器与空间光调制器的调制频率同步；

11、2)偏振激发光调制：

12、在空间光调制器加载的条纹方向改变从物镜倾斜出射激发光在样品平面的投影与x轴之间的夹角，x轴为样品平面的水平方向，加载的条纹频率改变倾斜出射的激发光相对于物镜光轴的夹角值，以物镜光轴为z轴；利用在空间光调制器上分别加载方向不同的n次条纹，n≥2，其中条纹的方向分别依次相差2π/n，从物镜出射的第n个倾斜光与x轴之间的夹角为αn＝α0+2π(n-1)/n，n＝1,…,n，其中α0为第一个倾斜出射的激发光与x轴之间的夹角；空间光调制器上加载的第n次条纹的频率为fn，第n个倾斜出射的激发光与物镜光轴之间的夹角为βn；入射到样品的激发光的偏振态与传输方向有关，激发光的传输方向改变，偏振态相应发生改变；空间光调制器加载设定的不同方向的条纹，会使得从物镜分别出射n个不同角度的倾斜出射的激发光，激发光的传输方向的变化使得对应从物镜倾斜出射的激发光的偏振态改变，该过程称为偏振激发调制，n次偏振激发调制为一个调制周期；从物镜倾斜出射的激发光的偏振态的改变，使得荧光偶极子的激发效率发射改变，对应的发射荧光强度也发生改变；

13、3)利用探测器采集得到荧光图像；

14、4)得到荧光偶极子的发射荧光强度：

15、构建荧光偶极子对于偏振激发光调制的响应模型：

16、在空间光调制器上分别加载n次不同方向的条纹，从物镜分别出射n个不同角度的倾斜出射的激发光，其中p偏振的第n次倾斜出射的激发光为荧光偶极子的电

17、偶极矩对于偏振激发调制的周期性响应与余弦函数平方相关：

18、

19、其中，gn为第n次偏振激发调制的荧光偶极子的发射荧光强度，n＝1,…,n；αn为激发光在水平面上投影与x轴之间的夹角，βn为第n个倾斜出射的激发光与物镜光轴之间的夹角；ρ和η分别为荧光偶极子的方位角(面内角)和极角(面外角)，分别描述了荧光偶极子在水平面上投影与x轴之间的夹角和荧光偶极子与z轴之间的夹角；第n次偏振激发调制时到达探测器的光子数qn＝i0(∑gn*h+b)，h为系统点扩展函数，用于描述成像过程中的衍射现象；b表示背景，被建模为在短时间内偏振不变的量，i0表示在光学系统中对于非均匀的响应，即依赖于偏振的周期校正因子；光子到达探测器具有统计不确定性，通常用泊松分布统计模型来描述该统计不确定性，因此，第n次偏振激发调制时探测器采集到的第n次偏振激发调制的荧光偶极子的荧光图像in由到达探测器的光子数qn的泊松分布表示：in～possion(qn)；从探测器采集到的第n次偏振激发调制的荧光偶极子的荧光图像in得到第n次偏振激发调制时到达探测器的光子数，再从第n次偏振激发调制时到达探测器的光子数得到第n次偏振激发调制的荧光偶极子的发射荧光强度gn；

20、将n次的偏振激发调制的荧光偶极子的荧光图像进行叠加，得到宽场荧光图像i；

21、5)提取荧光偶极子三维角度信息：将第n次偏振激发调制的荧光偶极子的发射荧光强度gn展开为n项多项式之和，其表达式如下：

22、

23、其中，mnm为第n次偏振激发调制下第m偏振激发调制系数分量，m＝1,…,n，n＝1,…,n，与激发光中的αn和βn有关；dm为不随偏振激发调制改变的与第m偏振激发调制系数分量mnm相对应的荧光偶极子取向分量，与ρ和η相关，不随偏振激发调制次数变化；在角度提取中，不考虑系统点扩展函数和背景导致的模糊，将荧光偶极子的发射荧光强度表示为探测器的每个像素单元的偏振响应，探测器所有像素单元的偏振响应集合为探测器采集到的荧光图像；因此不同空间光调制器加载不同方向条纹下采集到的发射荧光光强，表达式如下：

24、

25、其中，a为与系统相关的常数项，m为偏振激发调制系数；通过利用偏振激发调制系数m的空间域逆变换m-1，在倒易空间中得到取向信息的组合：

26、

27、在dm(ρ,η)中包含有待求解的荧光偶极子取向信息，通过采集到的荧光图像和偏振激发调制系数的倒易空间，求解提取荧光偶极子的角度分量的信息，得到与宽场荧光图像相同尺寸的取向结果图；

28、6)将获得的角度分量的信息和荧光强度信息映射到荧光偶极子上，从而展示出三维取向信息。

29、在步骤5)中，相比于传统方法仅空间分辨的能力，本发明可以提供三维上的角度信息，从而增加了区分被测分子的维度。

30、在步骤6)中，公式(4)中对荧光图像与偏振激发调制系数的计算是逐像素单元的；宽场荧光图像与取向结果图是对应的，在宽场荧光图像上叠加取向结果图，在相同的像素单元位置，既反映了发射荧光强度也反映了三维取向信息；最终得到在空间-角度维度的分辨能力，提供三维取向信息，从而增加了区分被测分子的维度。

31、本发明的优点：

32、本发明采用在空间光调制器上加载不同方向的条纹改变从物镜倾斜出射的激发光的传输方向，激发光的传输方向改变，偏振态相应发生改变，从而进行偏振激发调制来增强相邻荧光团的成像稀疏性，通过将物镜出射的激发光倾斜来增强对沿样品平面垂直方向分布的荧光偶极子的激发，提升了原有技术对于沿样品平面垂直方向分布的荧光偶极子发射器的探测能力；本发明实现采用偏振激发技术，实现荧光偶极子的强度和三维取向维度成像，解析出荧光偶极子的偏振相位信息，对原有技术有着较大的功能提升。