一种酶诱发多肽自组装检测碱性磷酸酶活性的方法及装置

本发明涉及聚合物敏感膜离子选择性电极，具体的说是一种酶诱发多肽自组装检测碱性磷酸酶活性的方法及装置。

背景技术：

1、多肽自组装是多肽分子通过非共价键作用力包括疏水作用、范德华力、氢键、π-π堆积作用等聚集成有序的结构体如囊泡状、柱状、管状、球状和网状等。由于催化环境温和、易于实现疾病的诊断和治疗等优点，生物酶催化短肽原位自组装已被应用于靶点成像、肿瘤和细菌感染的诊断治疗等多个领域。基于探针标记的自组装多肽，研究者构建了多种生物传感器，实现对酶、微生物等的定性及定量检测。然而待测样品中复杂基质对目标物的识别或响应信号的读取产生一定的干扰，降低了目标物检测的灵敏度。

2、碱性磷酸酶广泛分布于人体各个部位，参与调节许多生物过程。碱性磷酸酶活性异常与多种疾病有关，如骨病、心血管疾病、癌症、炎症性疾病等。此外，碱性磷酸酶是海洋中广泛存在的酶，主要由浮游植物、浮游动物、细菌产生。在缺磷的海区，分泌碱性磷酸酶是海洋微生物最主要的应对方式，即通过水解大分子溶解态有机磷为小分子无机磷缓解磷限制。碱性磷酸酶活性被认为是磷限制的重要指标。因此，开发灵敏度高、响应速度快的碱性磷酸酶检测方法尤为重要。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于酶诱发多肽自组装高灵敏检测碱性磷酸酶活性的方法及装置

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

3、一种酶诱发多肽自组装检测碱性磷酸酶的方法，以磁珠表面修饰的磷酸化自组装多肽或其衍生物(多肽功能化磁珠)作为识别分子和信号传导分子，碱性磷酸酶将识别分子和信号传导分子去磷酸化，使其在离子交换剂掺杂的聚合物膜电极上产生电位响应，依据电位响应实现对碱性磷酸酶的定性和/或定量检测；所述磷酸化自组装多肽为ff(x)y(y)eee、ff(x)gey(y)、ff(x)ky(y)或上述多肽中的衍生物，其中，磷酸化位点位于多肽分子中的酪氨酸(y)上，x为苯丙氨酸(f)在多肽分子的数量，数量为1-4的正整数(1、2、3或4)，y为酪氨酸在多肽分子的数量，数量为1-2的正整数(1或2)。

4、上述记载磷酸化自组装多肽在修饰于磁珠上时在自组装多肽前可加入甘氨酸(g)用于间隔自组装多肽序列与磁珠，减小自组装位阻。

5、所述磷酸化自组装多肽为fffyyeee，其中，序列中至少一个y上磷酸化修饰；其在修饰于磁珠上时在自组装多肽前可加入甘氨酸(g)用于间隔自组装多肽序列与磁珠，减小自组装位阻。

6、进一步的说，所述磷酸化多肽序列为gggggfffyyeee，其中，序列中两个y上磷酸化修饰，多肽通过固相合成法获得，其状态为多肽冻干粉，可配制为一定浓度的多肽溶液。

7、进一步的说，以磁珠表面修饰的磷酸化自组装多肽或其衍生物作为碱性磷酸酶识别分子和信号传导分子，待检测样品中含碱性磷酸酶使识别分子和信号传导分子去磷酸化，使其亲水性降低，诱发其进行自组装并牵引磁珠团聚，在外加磁场作用下使其在离子交换剂掺杂的聚合物膜电极上产生电位响应，依据电位响应实现对碱性磷酸酶的定性和/或定量检测。

8、所述识别分子和信号传导分子去磷酸化，诱发其自组装使磁珠团聚，导致在外加磁场作用下萃取或吸附至离子交换剂掺杂的聚合物膜电极的多肽数量变化，进而改变电位响应，依据电位响应实现对碱性磷酸酶的定性和/或定量检测。

9、所述磁珠为二氧化硅或聚苯乙烯包裹的超顺磁四氧化三铁，其并与高纯度链霉亲和素共价结合，其中链霉亲和素用于与生物素标记的多肽结合。

10、所述磷酸化自组装多肽或其衍生物修饰于磁珠表面，具体是多肽或多肽衍生物经修饰固定在磁珠上；具体为：经氨基、羧基、氨基硫醇或生物素修饰的多肽与磁珠表面的羧基、氨基、巯基或链霉亲和素相互作用，从而修饰于磁珠表面。

11、例如，两端任意带有氨基和/或羧基的多肽与羧基化(或氨基化)的磁珠进行反应，多肽固定于磁珠上；

12、c端修饰氨基硫醇的多肽与表面巯基化的的磁珠进行反应，多肽固定于磁珠上；

13、n端和/或c端经生物素(biotin)标记的多肽与链霉亲和素修饰的磁珠进行反应,多肽固定于磁珠上；

14、多肽衍生物若其两端任意带有氨基和/或羧基与羧基化(或氨基化)的磁珠进行反应固定于磁珠上；

15、多肽衍生物若其c端修饰氨基硫醇的多肽与表面巯基化的的磁珠进行反应固定于磁珠上；等等。

16、所述磷酸化自组装多肽及其衍生物包含酸性或碱性氨基酸，加入至特定缓冲溶液中带有一定数量的正电荷或者负电荷，因此多肽功能化磁珠在特定缓冲溶液中同样带电荷；

17、所述离子交换剂掺杂的聚合物膜电极为电极底部粘附掺杂离子交换剂的聚合物膜，所述膜成分按重量份数计，20％-80％膜基体、20％-80％增塑剂，余量为离子交换剂；离子交换剂为阴离子交换剂或阳离子交换剂；其中，阴离子交换剂为三十二烷基甲基氯化铵、三十二烷基甲基氯化铵衍生物、三十四烷基甲基氯化铵或三十四烷基甲基氯化铵衍生物；阳离子交换剂为四(4-氯苯基)硼酸钾、四(对甲苯基)硼酸钠、四(3,5-二(三氟甲基)苯基)硼酸钠、二壬基萘磺酸、二壬基萘磺酸盐或硼酸盐或上述各化合物衍生物。

18、膜基体为聚氯乙烯，聚丁基丙烯酸酯，聚醚酰亚胺，橡胶或溶胶凝胶膜；增塑剂为邻硝基苯辛醚，二-2-乙基己基癸酯，癸二酸二丁酯或癸二酸二辛酯；

19、一种所述的酶诱发多肽自组装检测碱性磷酸酶的方法采用的装置，装置包括电化学检测池、指示电极、参比电极、电化学外部测量装置和外部磁场；所述指示电极、参比电极一端分别插入至电化学检测池，另一端分别通过导线与电化学外部测量装置相连接，外部磁场置于电化学检测池的下方；其中，所述指示电极为离子交换剂掺杂的聚合物膜电极。

20、所述外部磁场可以为小型圆柱状磁铁、平板磁铁或电磁铁。

21、所述聚合物膜电极可以为传统的内充液式聚合物敏感膜电极、新型固态电极或印刷电极。其中，印刷电极的指示电极可以为聚合物敏感膜覆盖的碳电极，参比电极可以为银-氯化银电极。

22、所述指示电极为单电极或电极阵列。

23、所述的电化学外部测量装置为电化学工作站、离子计或电位仪。

24、所述参比电极可以为饱和甘汞电极、银-氯化银电极；辅助电极可以为铂丝。

25、一种所述方法的应用，所述方法在检测环境中碱性磷酸酶中的应用。

26、利用所述方法在细菌表面碱性磷酸酶活性检测中的应用。

27、所述碱性磷酸酶可以为细胞、血液、水体、土壤中的碱性磷酸酶，或是细菌(铜绿假单孢杆菌、大肠杆菌等)表面的碱性磷酸酶。

28、所述细菌均能够表达碱性磷酸酶，包括铜绿假单胞杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等。

29、检测原理：本发明以磷酸化自组装多肽为信号识别分子及信号传导分子，利用碱性磷酸酶对磁珠表面多肽去磷酸化诱发多肽自组装，导致多肽功能化磁珠团聚，在外加磁场的作用下多肽功能化磁珠萃取或吸附至离子交换剂掺杂的聚合物膜离子选择性电极表面产生的电位响应改变，进而实现对碱性磷酸酶活性的检测。与以往磁控肽基电位型传感器检测目标物的原理不同，并非只改变多肽功能化磁珠的电荷密度，磁珠团聚使其与聚合物敏感膜的接触面积减小，与聚合物膜内产生离子交换的多肽数量大幅度较少，从而增大多肽功能化磁珠的电位响应改变，提高磁控肽基电位型传感器检测目标物的灵敏度。

30、此外，细菌均能够表达碱性磷酸酶，且细菌生长环境的理化性质(ph、无机磷含量等)影响细菌表面碱性磷酸酶活性，根据与不同环境下生长的细菌作用前后多肽功能化磁珠在聚合物膜电极表面的电位响应改变，能够评估不同环境水体富营养化或探究不同理化性质对细菌表达碱性磷酸酶的影响。本发明利用细菌表面碱性磷酸酶对自组装多肽的去磷酸化能够实现细菌表面碱性磷酸酶活性检测、细菌表达碱性磷酸酶机制分析、水体富养氧化评估等，因此具有通用性。

31、本发明的优点在于：

32、1.本发明以具有自组装功能的多肽为识别分子，自组装多肽对温度、光、ph、酶等各种物理、化学或生物刺激具有刺激响应的特性，且多肽具有良好的生物相容性及灵活的可修饰性，能够用于构建多种磁控肽基电位型传感器用于各种外部刺激的检测。

33、2.本发明利用外界磁场实现多肽功能化磁珠的快速分离，有效消除背景溶液中复杂基质对电极电位响应的干扰。

34、3.本发明将多肽修饰于磁珠表面，基于多肽与目标物作用后诱发多肽自组装体系的形成或裂解，导致磁珠表面电荷密度及萃取进入聚合物敏感膜的多肽数量发生较大改变，增大功能化磁珠的电位响应改变，从而提高磁控肽基电位型传感器检测目标物的灵敏度。

35、4.本发明利用掺杂离子交换剂的聚合物敏感膜离子选择性电极实现对多肽分子的直接电位检测，通过改变离子交换剂等聚合物敏感膜组分能够实现对带正电、负电或电中性多肽的分别检测，具有较好的普适性。