一种便携式可智能手机直接观测的液晶生物传感器及其在凝血酶检测中的应用

本发明属于生物传感器的，更具体地，涉及一种便携式可智能手机直接观测的液晶生物传感器及其在凝血酶检测中的应用。

背景技术：

1、凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶，参与人体生理及病理的一些反应，促进凝血、创伤修复等。凝血酶在凝血级联反应中起着关键作用。在功能上，它将纤维蛋白原转化为纤维蛋白链，并催化相关的凝血反应。人体内凝血酶的浓度变化异常会导致一些疾病的发生如血栓、脑梗等，而全球每年脑血栓、脑梗塞、心肌梗塞等与凝血相关的疾病每年会夺走1200万人生命，接近世界每年总死亡人数的1/4，已经成为人类健康的头号大敌，因此对凝血酶高灵敏性的检测至关重要。目前有许多技术被应用与凝血酶检测，比如电化学、荧光、化学发光和表面增强拉曼光谱等技术。但是这些方法不可避免的会面临步骤繁琐，耗时长，需要专业人员和专业设备进行操作等问题，而这些缺点会影响凝血酶检测的发展。因此，设计一种简便、灵敏和高精度的凝血酶检测方法与设备具有重要的意义。

2、液晶(lc)是介于固体和液体之间的一种特殊物质形态，因此其同时具有液体的流动性和晶体的光学性质。由于液晶基元的长程取向有序以及液晶具有各向异性，基于液晶的成像技术被广泛应用于液晶显示器，液晶热像摄影和液晶生物传感器等领域。其中，液晶生物传感器技术近年来逐渐引起研究者的广泛关注。液晶生物传感器的检测原理是液晶分子在功能化传感界面上的排列取向会随着目标物的加入而发生变化。由于液晶具有独特的双折射特性，由外部刺激产生的取向排列变化可以转换为在偏振光显微镜(pom)下肉眼可见的光学信息。

3、与其他分析技术相比，液晶生物传感器具有构造简单、便于携带、低成本、低能耗、响应速度快、无需标记、可肉眼直接观测、样品用量少、选择性好、灵敏度高、易于实现微型化和阵列化等优点。迄今为止，许多研究都使用了液晶来检测各种生化反应和生物分子，包括表面活性剂、蛋白质、酶、脂质、dna、细菌和病毒。液晶传感已被报道用来检测凝血酶，但是这些工作存在基板修饰复杂、无法实现便携式检测等不足。

技术实现思路

1、针对上述现有的技术问题，本发明的首要目的在于提供一种便携式可智能手机直接观测的液晶生物传感器组件，并用于检测凝血酶，其具有高灵敏度和优异的特异性。构建的便携式可智能手机直接观测的液晶生物传感器对凝血酶的检测线性范围可达到35.0-85.0ng/ml，检测限可达到22ng/ml。

2、为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

3、一种便携式可智能手机直接观测的液晶生物传感器组件，包括如下组分：

4、组分a：传感检测芯片，所述传感检测芯片为采用正辛基三氯硅烷处理的玻璃基底上再滴加液晶形成的阵列光学池芯片；

5、组分b：磷酸缓冲液；

6、组分c：十六烷基三甲基溴化铵，所述十六烷基三甲基溴化铵的浓度为4μmol/l～10μmol/l；

7、组分d：针对凝血酶的单链体型的dna核酸适配体，所述核酸适配体的浓度范围为3μmol/l～6μmol/l；

8、组分e：凝血酶标准品。

9、本发明中凝血酶的检测原理如下：在硅烷化修饰的载玻片基底表面紧贴阵列孔，在阵列孔中放置铜网，然后滴加液晶，用毛细管移除多余的液晶形成均匀的液晶薄膜，形成液晶生物传感器。当溴化十六烷基三甲铵溶液加入液晶生物传感器的阵列光学池中，溴化十六烷基三甲铵与液晶分子相互作用，使液晶分子垂直有序排列，偏光显微镜下液晶图像呈现黑暗的光学形貌；当将核酸适配体溶液与上述溴化十六烷基三甲铵溶液的反应液加入液晶生物传感器的阵列光学池芯片中，核酸适配体与溴化十六烷基三甲铵相互产生静电作用，降低溴化十六烷基三甲铵在界面的浓度从而破坏原先形成的溴化十六烷基三甲铵单层膜，导致液晶分子由垂直排列转变为平行/倾斜排列破坏液晶分子垂直有序排列，便携式偏光显微镜下液晶图像呈现明亮的光学形貌；当凝血酶、核酸适配体和溴化十六烷基三甲铵的反应液加入液晶生物传感器的阵列光学池中，凝血酶与核酸适配体特异性结合能够导致适配体的构型发生转变，从而阻止核酸适配体与溴化十六烷基三甲铵之间的静电作用，因此溴化十六烷基三甲铵在界面处重新形成溴化十六烷基三甲铵单层膜，导致液晶分子由平行/倾斜排列转变为垂直排列，便携式偏光显微镜下液晶图像逐渐呈现黑暗的光学形貌。

10、优选地，所述液晶为4-氰基-4'-戊基联苯。

11、优选地，所述缓冲溶液由nacl、kcl、na2hpo4和kh2po4组成。进一步优选地，所述缓冲溶液中组分组成如下：137mol/l nacl，2.7mmol/l kcl，4.3mmol/l na2hpo4，1.4mmol/lkh2po4。

12、在具体实施方式中，所述传感检测芯片(组分a)通过如下步骤制备：

13、(1)在通风橱中将新鲜配制的食人鱼溶液倒入载有玻璃载玻片的石英玻璃器皿，浸泡30～60min，目的是去除玻璃载玻片表面的有机污染物；然后分别依次用超纯水、无水乙醇冲洗，浸入至正辛基三氯硅烷溶液中处理20～40min，用二氯甲烷冲洗，干燥；

14、(2)所述步骤(1)制得的液晶生物传感基底通过硅胶框架和铜网划分为多个光学池单元，在放置铜网的液晶生物传感基底表面滴加液晶4-氰基-4′-戊基联苯(5cb)，形成液晶膜，制得传感检测芯片；

15、优选地，步骤(1)中所述正辛基三氯硅烷水溶液是将正辛基三氯硅烷溶解于去离子水中配制而成，正辛基三氯硅烷在溶液中的体积分数为0.015％～0.020％。

16、优选地，步骤(1)中所述食人鱼溶液为质量浓度98％的浓硫酸与质量浓度30％过氧化氢溶液按照体积比2：1混合获得。

17、优选地，步骤(1)中所述干燥的步骤为：氮气吹干，在80～110℃条件下干燥过夜。

18、进一步地，本发明的第二个目的在于提供一种便携式可智能手机直接观测的液晶生物传感器，包括：便携式偏光显微镜、上述便携式可智能手机直接观测的液晶生物传感器组件和用于对凝血酶浓度进行分析的智能手机。

19、优选地，所述便携式偏光显微镜包括基座、柱体和支撑架，其中：

20、所述基座上设置有样品台，所述样品台上放置有权利要求1～3任一项所述便携式可智能手机直接观测的液晶生物传感器组件，所述样品台上还设置有发光组件和偏振片；所述偏振片设置于液晶生物传感器组件和发光组件之间以产生线偏振光；

21、所述柱体与所述基座相连接并安装于基座上，所述柱体上设置有用于调节透镜组件开关或闭合的第一旋钮，以及用于调节透镜组件聚焦程度的第二旋钮；透镜组件被安装于柱体内部；

22、所述支撑架用于放置用于对凝血酶浓度进行分析的智能手机，所述支撑架上设置有贯穿于所述柱体的第一通孔，所述第一通孔用于观察所述液晶生物传感器组件，所述第一通孔上装有与所述偏振片方向呈90°的另一偏振片，智能手机的摄像头与所述第一通孔相对应。

23、优选地，所述用于对凝血酶浓度进行分析的智能手机带有摄像头。更具体地，必要时，智能手机的数字变焦可以与透镜组件镜头的光学变焦相结合，实现一定的放大范围。液晶生物传感器组件被放置在样品台上，可以在平面方向上调节，而液晶生物传感器可以通过调节透镜组件在垂直方向上放大和聚焦。

24、优选地，所述便携式偏光显微镜可以通过3d打印技术制备获得。本发明提供了一种基于智能手机和3d打印技术的低成本、简单便携的液晶光学传感装置，为基于液晶的凝血酶生物传感器提供了一个新的方便平台。所述液晶光学传感装置在家庭检测和医疗场所检测等具有高灵敏度和特异性的实际应用中显示出巨大的前景。

25、本发明的第三个目的在于提供所述便携式可智能手机直接观测的液晶生物传感器组件或所述便携式可智能手机直接观测的液晶生物传感器在凝血酶检测中的应用。

26、优选地，所述凝血酶的检测限为22ng/ml。

27、本发明的第四个目的在于提供一种液晶生物传感器检测凝血酶浓度的方法，包括以下步骤：

28、(1)将含有凝血酶的待测样品用pbs缓冲液稀释10～100倍，制得待测工作液溶液，用pbs缓冲液配制不同浓度的凝血酶标准品溶液；

29、(2)所述待测工作液溶液或所述凝血酶标准品溶液中加入用pbs缓冲液配制的核酸适配体溶液以及用pbs缓冲液配制的十六烷基三甲基溴化铵溶液，恒温孵育，制备得到待测反应液或凝血酶标准品反应液；

30、(3)所述凝血酶标准品反应液加入上述液晶生物传感器组件的组分a中，制备获得所述液晶生物传感器组件，使用便携式偏光显微镜观察相应的液晶光学图像，智能手机将图像依次进行旋转变换、图片裁剪、图像二值化和形态学闭运算处理，再自动检测切割出各个方格，分析光学池发生织构改变的面积占比，将发生织构变化部分的面积占比与标准品的浓度进行线性拟合，得到检测物浓度和织构变化面积占比之间的关系并绘制线性曲线；

31、(4)将步骤(2)制得的待测反应液加入上述液晶生物传感器组件的组分a中，制备获得所述液晶生物传感器组件，使用智能手机观测液晶光学图像，通过图像分析软件计算出液晶光学图像的变化面积比；

32、(5)将步骤(4)中得到的样品液晶织构发生变化的面积占比代入步骤(3)的线性曲线中，即得到待测样品中的凝血酶浓度。

33、优选地，所述步骤(1)中，所述凝血酶标准品溶液的浓度范围为35ng/ml～85ng/ml。

34、优选地，所述步骤(1)中，所述恒温孵育的温度为35～40℃，所述恒温孵育的时间为40～80min。

35、优选地，所述步骤(1)中，所述待测样品为受试者的血液或血清。

36、优选地，所述步骤(2)中，所述核酸适配体溶液：待测工作液溶液：溴化十六烷基三甲铵溶液的体积比为1：1：2。

37、优选地，在步骤(2)中，核酸适配体溶液通过如下方式配制：将核酸适配体的冻干粉末溶解于pbs缓冲液中，涡旋混匀制得所述核酸适配体溶液。核酸适配体的最优浓度为4μm。

38、优选地，在步骤(2)中，溴化十六烷基三甲铵溶液通过如下方式配制：将溴化十六烷基三甲铵加入pbs缓冲液超声波溶解制得所述溴化十六烷基三甲铵溶液，溶解时间为30～40min；优选地，所述溴化十六烷基三甲铵的最优浓度为10μm。关于ctab检测终浓度的优化，需要说明的是，在本技术中共设置了4、6、8、10和12μm 5个浓度梯度，其中，当ctab浓度≤8μm时，结果显示偏光显微镜下均为亮场，优选地，选择10μm的浓度。

39、优选地，所述发光组件为led。

40、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

41、(1)本发明提供了一种便携式可智能手机直接观测的液晶生物传感器组件及基于此种组件的便携式液晶生物传感器，所述便携式液晶生物传感器具有高灵敏度和优异的特异性，在优化的条件下，可以实现对凝血酶的定量检测，对凝血酶的检测线性范围为35.0-85.0ng/ml，检测限为22ng/ml。

42、(2)本发明提供的便携式可智能手机直接观测的液晶生物传感器组件及基于此种组件的便携式液晶生物传感器，其具有低成本、简单便携、快速、灵敏，试剂消耗少，样品处理时间短等优点。在家庭检测和医疗场所检测等具有高灵敏度和特异性的实际应用中显示出巨大的前景。