一种枇杷蜂蜜的检测鉴别方法与流程

本发明涉及食品检测，具体涉及一种枇杷蜂蜜的检测鉴别方法。

背景技术：

1、枇杷，是蔷薇科苹果亚科枇杷属的常绿乔木植物，枇杷原产于中国四川、湖北一带，现分布于长江流域以南，多在低山丘陵及平原地区栽培，花期10-12月，最适泌蜜温度为15～22℃，一个花期可产蜜10～20斤，丰产时每群蜂可产蜜30斤以上。枇杷蜜颜色为浅琥珀色，易结晶，结晶后多呈白色油脂状，并有独特的花香，蜜质细腻、甘甜上口。枇杷蜂蜜具有较高的营养价值，主要成分是葡萄糖和果糖，尚含少量蔗糖、蛋白质、维生素、有机酸、矿物质及酶类等活性物质，最具代表性的营养物质是单糖和活性物质，单糖能为人体补充大量的能量，而活性物质则是人体内多种生化反应的催化剂。同其它蜂蜜一样，枇杷蜜也具有润肠通便，润肺止咳，解毒、医疮、止痛，补中益气，调和诸药的作用。

2、因此，受经济利益驱使，枇杷蜜也存在掺假现象，严重扰乱了蜂蜜市场的正常秩序，制约了枇杷蜂蜜产业特色经济的发展。因此，建立一套鉴别枇杷蜂蜜真假的方法是亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、针对现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种枇杷蜂蜜的检测鉴别方法。

2、为了实现该目的，本发明的技术方案如下：

3、本发明的第一方面，提供了一种枇杷蜂蜜的检测鉴别方法，采用高效液相色谱结合指纹图谱方法以及高效液相色谱定量分析方法，检测鉴别枇杷蜂蜜，

4、其中，所述高效液相色谱法结合指纹图谱指认出枇杷蜂蜜中含有茴香酸，其具有式(ⅰ)所示的结构：

5、

6、进一步的，所述茴香酸的保留时间为51.94min；

7、进一步的，所述高效液相色谱法中，流动相a为浓度为0.18～0.22v/v％的乙酸水溶液，流动相b为浓度为0.18～0.22v/v％的乙酸甲醇溶液；更进一步优选的，所述高效液相色谱法中，流动相a为浓度为0.2v/v％的乙酸水溶液，流动相b为浓度为0.2v/v％的乙酸甲醇溶液；

8、进一步的，所述高效液相色谱法中，梯度洗脱程序为：

9、0～11min，流动相b由5v/v％上升至11v/v％；11～14min，流动相b由11v/v％上升至14v/v％；14～17min，流动相b由14v/v％上升至15v/v％；17～24min，流动相b由15v/v％上升至16v/v％；24～28min，流动相b由16％上升至17％；28～30min，流动相b由17v/v％上升至22v/v％；30～38min，流动相b由22v/v％上升至25v/v％；38～41min，流动相b由25v/v％上升至30v/v％；41～46min，流动相b由30v/v％上升至33v/v％；46～55min，流动相b保持33％不变；55～60min，流动相b由33v/v％上升至34v/v％；60～70min，流动相b由34v/v％上升至36v/v％；70～80min，流动相b由36％上升至40％；80～90min，流动相b由40v/v％上升至45v/v％；90～100min，流动相b由45v/v％上升至52v/v％；100～110min，流动相b由52v/v％上升至57v/v％；110～120min，流动相b由57％上升至65％；120～130min，流动相b由65v/v％上升至70v/v％；130～135min，流动相b由70v/v％上升至80v/v％；流动相a随流动相b的体积变化而变化，两者体积加和为100％；流动相a随流动相b的体积变化而变化，两者体积加和为100％；

10、进一步的，所述高效液相色谱法中，包括以下色谱条件：

11、色谱柱为phenomenex gemini c18色谱柱，流速为0.6～0.8ml/min，进样量为10～30μl，柱温为34～36℃，检测波长为280nm；进一步优选的，所述进样量为20μl，所述流速为0.7ml/min，所述柱温为35℃；

12、进一步的，所述高效液相色谱法中，还包括前处理步骤：

13、s1:将待测蜂蜜与适量水混合后，使蜂蜜充分溶解获得蜂蜜水溶液液，调节所述蜂蜜水混合液ph值为6.5～7，然后以8800-9200rpm的转速将其离心18～22min后，取上清液备用；

14、s2：采用strata-x-a固相萃取柱提取s1获得的上清液，以甲醇活化固相萃取柱，然后采用超纯水平衡萃取柱，然后将所述上清液上样后，再以去离子水淋洗，之后采用含9～11v/v％甲酸的甲醇溶液洗脱，提取所述上清液中的活性成分获得洗脱液，然后将获得的洗脱液吹干，以适量甲醇复溶后，过滤获得，其中，所述甲醇、超纯水、去离子水以及含9～11v/v％甲酸的甲醇溶液的用量均为2～4倍量的柱体积；

15、进一步的，s1中，调节ph值为6.8，所述离心转速为9000rpm，所述离心时间为20min；

16、进一步的，s2中，所述过滤滤膜的孔径为0.22μm；

17、进一步的，s2中，所述洗脱剂含浓度为10v/v％甲酸的甲醇溶液；

18、进一步的，s2中，所述甲醇、超纯水、去离子水以及含9～11v/v％甲酸的甲醇溶液的用量均为3倍量的柱体积；

19、进一步的，所述高效液相色谱法结合指纹图谱指认出绿原酸、异绿原酸、3-o-对香豆酰基奎宁酸、5-o-阿魏酰奎宁酸、金丝桃苷(即槲皮素-3-o-葡萄糖苷)、顺,顺,顺-三-对-香豆酰亚精胺、顺,顺,反-三-对-香豆酰亚精胺、顺,反,顺-三-对-香豆酰亚精胺、反,反,反-三-对-香豆酰亚精胺；

20、更进一步的，所述绿原酸的保留时间tr为22.21min、异绿原酸的保留时间tr为30.17min、3-o-对香豆酰基奎宁酸的保留时间tr为34.82min、5-o-阿魏酰奎宁酸的保留时间tr为40.53min、金丝桃苷(即槲皮素-3-o-葡萄糖苷)的保留时间tr为59.59min、顺,顺,顺-三-对-香豆酰亚精胺的保留时间tr为87.06min、顺,顺,反-三-对-香豆酰亚精胺的保留时间tr为96.22min、顺,反,顺-三-对-香豆酰亚精胺的保留时间tr为102.07min、反,反,反-三-对-香豆酰亚精胺的保留时间tr为107.36min；

21、进一步的，所述高效液相色谱定量分析方法包括：

22、(1)色谱条件：同上述高效液相色谱结合指纹图谱方法；

23、(2)配制枇杷蜜标准品溶液：称取适量的绿原酸、异绿原酸、3-o-对香豆酰基奎宁酸、5-o-阿魏酰奎宁酸、茴香酸、金丝桃苷、三-p-香豆酰亚精胺配置成标准品溶液，浓度分别为0.22mg/ml，0.8mg/ml，0.64mg/ml，0.32mg/ml，0.6mg/ml，0.56mg/ml，3.6mg/ml，绘制枇杷蜜标准曲线如下表1所示：采用5点法，根据上样量x以及峰面积y，按5～10ul的梯度进样量进行校正；优选的，绿原酸、异绿原酸、3-o-对香豆酰基奎宁酸、5-o-阿魏酰奎宁酸、茴香酸、金丝桃苷、三-p-香豆酰亚精胺标准品溶液浓度分别为0.22mg/ml，0.8mg/ml，0.64mg/ml，0.32mg/ml，0.6mg/ml，0.56mg/ml，3.6mg/ml；

24、表1标准品的相关信息

25、

26、(3)含量测定法：按照步骤(1)所述方法将样品溶液进样，按照相应tr获得色谱峰峰面积代入相应的标准品曲线中，求得该化合物在蜂蜜中的含量，其中，绿原酸的含量不低于0.12～1.22mg/kg，异绿原酸的含量为0.11-0.94mg/kg，3-o-对香豆酰基奎宁酸的含量为0.28～1.72mg/kg，5-o-阿魏酰奎宁酸含量不显著低于0.14～0.58mg/kg，茴香酸含量不低于3.30-9.64mg/kg，金丝桃苷含量不低于0.14～2.15mg/kg，顺,顺,顺-三-对-香豆酰亚精胺的含量不低于0.50～3.07mg/kg，顺,顺,反-三-对-香豆酰亚精胺的含量不低于0.68～2.45mg/kg，反,顺,反-三-对-香豆酰亚精胺含量不显著低于0.74～2.85mg/kg，反,反,反-三-对-香豆酰亚精胺的含量不低于0.37～2.88mg/kg；

27、本发明的第二方面提供了茴香酸在枇杷蜂蜜鉴别或检测中的应用。

28、有益效果

29、1.本发明采用固相萃取提取方法对枇杷蜂蜜活性成分进行提取分离，并采用hplc结合指纹图谱法以及hplc定量分析方法建立了枇杷蜂蜜中植物化合物定性分析以及定量分析方法。

30、2.本分析方法鉴定出了枇杷蜂蜜中含有代表性的化合物，分别为绿原酸、异绿原酸、3-o-对香豆酰基奎宁酸、5-o-阿魏酰奎宁酸、金丝桃苷(即槲皮素-3-o-葡萄糖苷)、顺,顺,顺-三-对-香豆酰亚精胺、顺,顺,反-三-对-香豆酰亚精胺、顺,反,顺-三-对-香豆酰亚精胺、反,反,反-三-对-香豆酰亚精胺，获得的枇杷蜂蜜植物化合物hplc图谱。将该图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，初步模拟生成了具有代表意义的枇杷蜂蜜标准指纹图谱。

31、通过与洋槐蜜、椴树蜜、荆条蜜、油菜蜜四种大宗单花蜜的hplc图谱的比较，以及对收集的其他小众蜂蜜如红花蜜、五倍子蜜、荞麦蜜、益母草蜜、枸杞蜜等的植物化合物的分析对比，均未在枇杷蜂蜜以外的其他单花蜜中同时检测出化合物绿原酸、异绿原酸、3-o-对香豆酰基奎宁酸、5-o-阿魏酰奎宁酸、茴香酸、金丝桃苷和顺,顺,顺-三-对-香豆酰亚精胺、顺,顺,反-三-对-香豆酰亚精胺、顺,反,顺-三-对-香豆酰亚精胺、反,反,反-三-对-香豆酰亚精胺。证明了这10种成分可作为枇杷蜂蜜的特征性植物化合物标记物，本发明涉及一种枇杷蜂蜜的检测鉴别方法，采用高效液相色谱结合指纹图谱方法以及高效液相色谱定量分析方法，检测鉴别枇杷蜂蜜，其中，高效液相色谱法结合指纹图谱指认出枇杷蜂蜜中同时含有茴香酸，绿原酸、异绿原酸、3-o-对香豆酰基奎宁酸、5-o-阿魏酰奎宁酸、金丝桃苷(即槲皮素-3-o-葡萄糖苷)、顺,顺,顺-三-对-香豆酰亚精胺、顺,顺,反-三-对-香豆酰亚精胺、顺,反,顺-三-对-香豆酰亚精胺以及反,反,反-三-对-香豆酰亚精胺，则可判定所述待测蜂蜜为枇杷蜂蜜。

32、本发明为枇杷蜂蜜真实性及品质评价体系的构建提出了新的方法，具有专属性高、检测灵敏度好，具有良好的经济价值和社会意义。