青叶胆的特征图谱构建方法及其应用与流程

本发明涉及中药材检测领域，特别是涉及一种青叶胆的特征图谱构建方法及其应用。

背景技术：

1、《中国药典》2020年版所收载的青叶胆为龙胆科植物青叶胆(swertia mileensist.n.ho et w.l.shih)的干燥全草，主产于云南，主要含有环烯醚萜苷类、三萜类、黄酮类等化合物，具有清肝利胆，清热利湿的功效，常用于肝胆湿热，黄疸尿赤，胆胀胁痛，热淋涩痛等症。青叶胆中的环烯醚萜苷类成分是主要的活性成分，诸如马钱苷酸、龙胆苦苷、獐牙菜苷、獐牙菜苦苷等，尤其是獐牙菜苦苷，具有保护肝脏、消炎、缓解疼痛等药理作用。

2、《中国药典》2020年版一部青叶胆含量测定项下规定獐牙菜苦苷含量不得低于8.0％。目前市售的青叶胆药材獐牙菜苦苷含量整体偏低，不合格率超65％，严重影响了临床用药的有效性。而传统技术主要采用hplc研究青叶胆药材，比如黎氏文梅在“青叶胆和圈纹獐牙菜的质量等同性及抗肝纤维化作用研究”中利用hplc指纹图谱对青叶胆和圈纹獐牙菜作对比研究；李耀利在“云南产青叶胆及其习用品药材中5种成分的hplc含量测定”中建立了青叶胆獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、芒果苷、红白金花内酯、龙胆苦苷的含量同时测定的方法。上述方法共有峰较少，较难全面反映青叶胆药材的质量特征。另外，青叶胆为全草类中药，秋季花果期采收，根、茎、叶、花中化学成分分布存在较大差异，对药材的测定结果有较大影响。

技术实现思路

1、基于此，有必要提供一种青叶胆的特征图谱构建方法，通过该方法建立青叶胆药材或其不同部位的的特征图谱，其中包含15个共有峰，并且能同时测定青叶胆药材及不同部位中马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷四个指标成分的含量，同步实现青叶胆药材及不同部位的特征图谱和多指标成分含量的检测，有利于青叶胆的质量控制与评价。

2、本发明是通过以下技术方案实现。

3、一种青叶胆的特征图谱构建方法，所述构建方法包括如下步骤：

4、取马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷对照品制备混合对照品溶液；

5、取青叶胆药材或其不同部位制备供试品溶液；

6、分别对所述混合对照品溶液及所述供试品溶液进行超高效液相色谱测定；

7、其中，所述超高效液相色谱采用的洗脱条件为：以乙腈为流动相a，以磷酸水溶液为流动相b，采用梯度洗脱。

8、在其中一个实施例中，所述梯度洗脱的方法为：

9、0～7min，保持流动相a的体积百分数为8％；

10、7min～16min，流动相a的体积百分数由8％变化至10％；

11、16min～16.5min，流动相a的体积百分数由10％变化至17％；

12、16.5min～24min，保持流动相a的体积百分数为17％；

13、24min～26min，流动相a的体积百分数由17％变化至23％；

14、26min～39min，流动相a的体积百分数由23％变化至24％；

15、39min～40min，流动相a的体积百分数由24％变化至8％；

16、40min～45min，保持流动相a的体积百分数为8％。

17、在其中一个实施例中，所述磷酸水溶液中，磷酸的体积分数为0.05％～0.15％。

18、在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱分析条件包括如下特征中的一项或多项：

19、(1)色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

20、(2)检测波长：0～18.5min，240nm，18.5min～45min，210nm；

21、(3)柱温为28℃～32℃；

22、(4)流速为0.23ml/min～0.27ml/min。

23、在其中一个实施例中，所述制备混合对照品溶液包括如下步骤：

24、将所述马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷对照品与体积浓度为70％～100％的甲醇水溶液混合，过滤，取续滤液，即得；及/或，

25、所述制备供试品溶液包括如下步骤：

26、分别取所述青叶胆药材或其不同部位与体积浓度为70％～100％的甲醇水溶液混合，进行超声提取，过滤，取续滤液，即得。

27、在其中一个实施例中，所述超声提取的条件包括：功率为250w～300w；频率为30khz～50khz；时间为30min～40min。

28、在其中一个实施例中，所述青叶胆药材或其不同部位的特征图谱中特征峰的数量均为15，其中峰1为马钱苷酸，峰3为獐牙菜苦苷，峰4为龙胆苦苷，峰5为獐牙菜苷。

29、在其中一个实施例中，所述不同部位包括青叶胆根、青叶胆茎、青叶胆叶或青叶胆花。

30、本发明还提供一种青叶胆的指标成分含量检测方法，所述指标成分为马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷中的一种或多种，所述检测方法包括如下步骤：

31、取马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷对照品中的一种或多种制备对照品溶液；

32、取青叶胆药材或其不同部位分别制备待测样品溶液；

33、将所述对照品溶液稀释成不同浓度进行超高效液相色谱分析，根据浓度和峰面积构建所述指标成分的第一回归方程；

34、将所述待测样品溶液进行超高效液相色谱分析，结果代入所述第一回归方程，计算所述指标成分的含量；

35、其中，所述超高效液相色谱采用的洗脱条件为：以乙腈为流动相a，以磷酸水溶液为流动相b，采用梯度洗脱。

36、在其中一个实施例中，所述梯度洗脱的方法为：

37、0～7min，保持流动相a的体积百分数为8％；

38、7min～16min，流动相a的体积百分数由8％变化至10％；

39、16min～16.5min，流动相a的体积百分数由10％变化至17％；

40、16.5min～24min，保持流动相a的体积百分数为17％；

41、24min～26min，流动相a的体积百分数由17％变化至23％；

42、26min～39min，流动相a的体积百分数由23％变化至24％；

43、39min～40min，流动相a的体积百分数由24％变化至8％；

44、40min～45min，保持流动相a的体积百分数为8％。

45、在其中一个实施例中，所述磷酸水溶液中，磷酸的体积分数为0.05％～0.15％。

46、在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱分析条件包括如下特征中的一项或多项：

47、(1)色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

48、(2)检测波长：0～18.5min，240nm，18.5min～45min，210nm；

49、(3)柱温为28℃～32℃；

50、(4)流速为0.23ml/min～0.27ml/min。

51、在其中一个实施例中，所述制备对照品溶液包括如下步骤：

52、将所述马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷对照品中的一种或多种与体积浓度为70％～100％的甲醇水溶液混合，过滤，取续滤液，即得；及/或，

53、所述制备待测样品溶液包括如下步骤：

54、分别取所述青叶胆药材或其不同部位与体积浓度为70％～100％的甲醇水溶液混合，进行超声提取，过滤，取续滤液，即得。

55、在其中一个实施例中，所述超声提取的条件包括：功率为250w～300w；频率为30khz～50khz；时间为30min～40min。

56、在其中一个实施例中，以浓度为横坐标x，峰面积为纵坐标y，所述指标成分为马钱苷酸，所述第一回归方程为y＝6.066x-0.7953，相关系数r2＝0.9999，线性范围为0.2104μg/ml～21.0375μg/ml；所述指标成分为獐牙菜苦苷，所述第一回归方程为y＝6.7806x-44.191，相关系数r2＝0.9999，线性范围为11.6992μg/ml～1169.9175μg/ml；所述指标成分为龙胆苦苷，所述第一回归方程为y＝4.9953x-0.6015，相关系数r2＝0.9999，线性范围为0.1893μg/ml～18.9345μg/ml；所述指标成分为獐牙菜苷，所述第一回归方程为y＝6.2453x-1.6015，相关系数r2＝0.9998，线性范围为0.3896μg/ml～38.9550μg/ml。

57、在其中一个实施例中，所述不同部位包括青叶胆根、青叶胆茎、青叶胆叶或青叶胆花。

58、本发明还提供一种青叶胆的检测方法，包括如下步骤：

59、取青叶胆药材或其不同部位分别制备待测样品溶液；

60、将所述待测样品溶液进行超高效液相色谱分析，结果代入上述根据浓度和峰面积构建的所述指标成分的第一回归方程，计算指标成分的含量，以及将所述结果与根据青叶胆的特征图谱构建方法构建获得的特征图谱进行比对。

61、本发明还提供一种青叶胆的质量快速预测的方法，包括如下步骤：

62、取青叶胆药材或其不同部位分别制备待测样品溶液；

63、将所述待测样品溶液进行超高效液相色谱分析，结果代入上述根据浓度和峰面积构建的所述指标成分的第一回归方程，计算指标成分的含量；

64、将所述青叶胆药材或其不同部位进行色度值测定，获取青叶胆药材或其不同部位的色度值l*、a*、b*，并计算得到总色度值e*；

65、对所述指标成分含量与所述色度值进行pearson相关性分析。

66、在其中一个实施例中，所述色度值测定包括如下步骤：

67、取所述青叶胆药材或其不同部位进行破碎，过筛后进行压制，测定。

68、在其中一个实施例中，所述色度值测定的条件包括：光源d65，视角10°，孔径4mm。

69、在其中一个实施例中，所述的青叶胆的质量快速预测的方法还包括如下步骤：

70、根据青叶胆药材或其不同部位的色度值与指标成分含量的pearson相关性，筛选出与青叶胆指标成分含量存在显著相关性的色度值指标，以色度值为横坐标x，指标成分含量为纵坐标y，构建第二回归方程。

71、在其中一个实施例中，所述青叶胆指标成分獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷含量与l*、b*、e*呈显著正相关；

72、以色度值为横坐标x，指标成分含量为纵坐标y，所述獐牙菜苦苷含量与色度值l*的第二回归方程为y＝3.033x-121.06，所述獐牙菜苦苷含量与色度值b*的第二回归方程为y＝10.12x-182.44，所述獐牙菜苦苷含量与色度值e*的第二回归方程为y＝3.7941x-170.4；

73、以色度值为横坐标x，指标成分含量为纵坐标y，所述龙胆苦苷含量与色度值l*的第二回归方程为y＝0.0426x-1.6247，所述龙胆苦苷含量与色度值b*的第二回归方程为y＝0.1012x-1.6802，所述龙胆苦苷含量与色度值e*的第二回归方程为y＝0.0468x-2.1252；

74、以色度值为横坐标x，指标成分含量为纵坐标y，所述獐牙菜苷含量与色度值l*的第二回归方程为y＝0.0783x-3.2808，所述獐牙菜苷含量与色度值b*的第二回归方程为y＝0.2116x-4.0246，所述獐牙菜苷含量与色度值e*的第二回归方程为y＝0.088x-4.3278。

75、与现有技术相比较，本发明具有如下有益效果：

76、本发明利用超高效液相色谱法，结合合适的流动相设置，构建了青叶胆的特征图谱，该特征图谱包含15个共有峰，图谱信息丰富，其中4个峰分别与相应对照品的参照物峰的保留时间相对应，能够快速、全面地实现对青叶胆多个指标成分的质量监控，进而为青叶胆提供一种较为全面、客观、快速的质量评价方法，且方法操作简便、重复性好。