一种野桂花蜂蜜的检测鉴别方法与流程

本发明涉及食品检测，具体涉及一种野桂花蜂蜜的检测鉴别方法。

背景技术：

1、野桂花蜜采自柃木，是五列木科柃属的灌木，主要分布于产于湖南、广西、广东等地。花期为9-10月，野桂花是我国商品蜜中最稀有、品质上乘、味道最香甜的蜂蜜，气味清香甜而不腻，颜色为水白色，具有细腻的结晶。

2、野桂花中含有游离氨基酸、丰富的蛋白质、具有一定的加强新陈代谢的功效，野桂花蜜也被称作“蜜中之王”。现代医学临床应用证明，蜂蜜可促进消化吸收、增进食欲、镇静安眠、提高机体抵抗力，对促进婴幼儿的生长发育有着积极作用。蜂蜜可用于体弱多病、病后恢复的辅助治疗。患有高血压的老人，每天早、晚各饮1杯蜂蜜水是非常有益的，因为蜜中的钾进入人体后有排钠的作用，可维持血中电解质平衡；慢性肝炎、肝功能不良患者常吃蜂蜜能改善肝功能；对于肺结核、胃肠道溃疡等慢性病患者，蜂蜜是良好的营养品，能增强体质。

3、因此，受经济利益驱使，野桂花蜂蜜也存在掺假现象，严重扰乱了蜂蜜市场的正常秩序，制约了野桂花蜂蜜产业特色经济的发展。因此，建立一套鉴别野桂花蜂蜜真假的方法是亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、针对现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种野桂花蜂蜜的检测鉴别方法。

2、为了实现该目的，本发明的技术方案如下：

3、本发明的第一方面，提供了一种野桂花蜂蜜的检测鉴别方法，采用高效液相色谱结合指纹图谱方法以及高效液相色谱定量分析方法，检测鉴别野桂花蜂蜜，

4、其中，所述高效液相色谱法结合指纹图谱指认出野桂花蜂蜜中含有柃木醇a，其具有式(1)所示的结构：

5、

6、进一步的，所述柃木醇a的保留时间为42.60min；

7、进一步的，所述高效液相色谱法中，流动相a为浓度为0.18～0.22v/v％的乙酸水溶液，流动相b为含0.18～0.22v/v％的乙酸甲醇溶液；

8、更进一步的，所述高效液相色谱法中，梯度洗脱程序为：0～11min，流动相b由9v/v％上升至14v/v％；11～14min，流动相b由14v/v％上升至15v/v％；14～17min，流动相b保持15v/v％；17～24min，流动相b由15v/v％上升至16v/v％；24～28min，流动相b由16v/v％上升至17v/v％；28～30min，流动相b由17v/v％上升至22v/v％；30～41min，流动相b保持22v/v％；41～46min,流动相b由22v/v％上升至23v/v％；46～55min，流动相b由23v/v％上升至25v/v％；55～60min，流动相b由25v/v％上升至28v/v％；60～70min，流动相b由28v/v％上升至30v/v％；70～80min，流动相b由30v/v％上升至40v/v％；80～90min，流动相b由40v/v％上升至45v/v％；90～100min，流动相b由45v/v％上升至52v/v％；100～110min，流动相b由52v/v％上升至57v/v％；110～120min，流动相b由57v/v％上升至65v/v％；120～130min，流动相b由65v/v％上升至70v/v％；130～135min，流动相b由70v/v％上升至80v/v％；流动相a随流动相b的体积变化而变化，两者体积加和为100％；

9、进一步的，所述高效液相色谱法中，还包括以下色谱条件：

10、色谱柱为phenomenex gemini c18色谱柱，流速为0.6～0.8ml/min，进样量为20μl，柱温为34～36℃，检测波长为270nm；进一步优选的，所述流速为0.7ml/min，所述柱温为35℃；

11、进一步优选的，所述高效液相色谱法中，流动相a为浓度为0.2v/v％的乙酸水溶液，流动相b为含0.2v/v％的乙酸甲醇溶液；

12、进一步的，所述高效液相色谱法中，还包括前处理步骤：

13、s1：将待测蜂蜜与适量水混合后，使蜂蜜充分溶解获得蜂蜜水溶液液，调节所述蜂蜜水混合液ph值为6.5～7，然后以8800-9200rpm的转速将其离心18～22min后，取上清液备用；

14、s2：采用strata-x-a固相萃取柱提取s1获得的上清液，以甲醇活化固相萃取柱，然后采用超纯水平衡萃取柱，然后将所述上清液上样后，再以去离子水淋洗，之后采用含9～11v/v％甲酸的甲醇溶液洗脱，提取所述上清液中的活性成分获得洗脱液，然后将获得的洗脱液吹干，以适量甲醇复溶后，过滤获得，其中，所述甲醇、超纯水、去离子水以及含9～11v/v％甲酸的甲醇溶液的用量均为2～4倍量的柱体积；

15、进一步的，s1中，调节ph值为6.8，所述离心转速为9000rpm，所述离心时间为20min；

16、进一步的，s2中，所述过滤滤膜的孔径为0.22μm；

17、进一步的，s2中，所述洗脱剂含浓度为10v/v％甲酸的甲醇溶液；

18、进一步的，s2中，所述甲醇、超纯水、去离子水以及含9～11v/v％甲酸的甲醇溶液的用量均为3倍量的柱体积；

19、更进一步的，所述高效液相色谱法结合指纹图谱指认出野桂花蜂蜜中还含有苦蜜素a、6r,9s-吐叶醇、红花菜豆酸、反,反-脱落酸、冬蜜素以及顺,反-脱落酸；

20、更进一步的，所述苦蜜素a、6r,9s-吐叶醇、红花菜豆酸、反,反-脱落酸、冬蜜素、顺,反-脱落酸的保留时间分别为31.41min，44.61min、50.47min、65.37min、67.79min、75.45min；

21、进一步的，所述高效液相色谱定量分析方法包括：

22、(1)色谱条件同上述高效液相色谱结合指纹图谱方法；

23、(2)配制野桂花蜜标准品溶液：称取适量苦蜜素a、6r,9s-吐叶醇、柃木醇a、冬蜜素以及脱落酸配制成标准品溶液，浓度分别为0.4～0.6mg/ml，0.7～0.8mg/ml，0.5～0.7mg/ml，0.5～0.6mg/ml，0.4～0.5mg/ml，绘制野桂花蜜标准曲线如表1所示，采用5点法，根据上样量x以及峰面积y，按5～10ul的梯度进样量进行校正；优选的，所述苦蜜素a、6r,9s-吐叶醇、柃木醇a、冬蜜素以及脱落酸标准品溶液浓度分别为0.5mg/ml，0.72mg/ml，0.6mg/ml，0.56mg/ml，0.48mg/ml；

24、(3)检测样品：按照步骤(1)所述方法将样品溶液进样，按照相应tr获得色谱峰峰面积代入相应的标准品曲线中，求得该化合物在蜂蜜中的含量，柃木醇a含量不低于0.40mg/kg，冬蜜素含量不低于2.50mg/kg且6r,9s-吐叶醇含量不低于12.30mg/kg。

25、表1标准品的相关信息

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27、

28、本发明的第二方面提供了柃木醇a在野桂花蜂蜜鉴别或检测中的应用。

29、有益效果

30、1.本发明采用固相萃取提取方法对野桂花蜂蜜活性成分进行提取分离，并采用hplc结合指纹图谱法以及hplc定量分析方法建立了野桂花蜂蜜中植物化合物定性分析以及定量分析方法。

31、2.本分析方法鉴定出了野桂花蜂蜜中含有代表性的7种化合物，分别为苦蜜素a、柃木醇a、6r,9s-吐叶醇、红花菜豆酸、反,反-脱落酸、冬蜜素、顺,反-脱落酸，获得的野桂花蜂蜜植物化合物hplc图谱。将该图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，初步模拟生成了具有代表意义的野桂花蜂蜜标准指纹图谱。

32、通过与洋槐蜜、椴树蜜、荆条蜜、油菜蜜四种大宗单花蜜的hplc图谱的比较，以及对收集的其他小众蜂蜜如红花蜜、五倍子蜜、荞麦蜜、益母草蜜、枸杞蜜等的植物化合物的分析对比，均未在野桂花蜂蜜以外的其他单花蜜中同时检测出化合物苦蜜素a、柃木醇a、6r,9s-吐叶醇、红花菜豆酸、反,反-脱落酸、冬蜜素、顺,反-脱落酸。证明了这七种成分可作为野桂花蜂蜜的特征性植物化合物标记物，并应用于野桂花蜂蜜真实性及品质评价，对保护蜂蜜消费者的合法权益和维护蜂蜜消费行业的健康发展具有重要现实意义。