检测吡仑帕奈原料药中基因毒性杂质的方法与流程

本技术涉及本发明属于化学药物分析检测领域，具体涉及检测吡仑帕奈原料药中五种基因毒性杂质的方法。

背景技术：

1、在整个说明书中对现有技术的任何讨论都不应被视为承认这些现有技术是广为人知的，或构成本领域公知常识的一部分。

2、吡仑帕奈(perampanel，商品名fycompa)是一种新型的抗癫痫药物，由日本卫材制药(eisai)公司研发，于2012年在欧盟和美国上市，2019年在中国获批。它的作用机制是通过非竞争性地拮抗突触后神经元的α-氨基-3羟基-5甲基-4异噁唑受体(ampar)，抑制过度兴奋的谷氨酸介导的神经递质释放，从而降低癫痫发作的发生。它主要用于治疗12岁及以上儿童癫痫部分性发作患者(伴或不伴继发性全面性癫痫发作)的辅助治疗，也可用于治疗原发性全面性强直阵挛发作。目前临床上可用的剂型为片剂和口崩片剂。

3、吡仑帕奈的化学名为[2-(6'-氧代-1'-苯基-1',6'-二氢-[2,3'-联吡啶]-5'-基)苄腈]四分之三水合物，其分子式为c23h15n3o·3/4h2o，分子量为362.90g/mol，cas号为380917-97-5。它的工艺路线是以邻溴苯乙酸和苯胺为起始原料，经缩合，氰化，环合生成吡仑帕奈。基因毒性杂质主要来源于原料合成过程中的起始物料、中间体、试剂及反应副产物，也可在药物贮存中降解产生。

4、ich m7(r1)是国际药品注册技术要求协调会(ich)制定的一份指导原则，它针对药物中可能含有的dna反应性杂质，即能够与dna发生反应并引起突变的杂质，制定了评估和控制的标准和方法，旨在降低这些杂质对人体的致癌风险。该指导原则提供了一个致突变杂质的鉴别、分类、定性和控制的框架方案，涵盖了计算机模拟预测、实验室检测和风险评估等步骤。计算机模拟预测是利用已知的化学结构和生物活性之间的关系，对药物中可能存在的dna反应性杂质进行预测；实验室检测是利用细菌或哺乳动物细胞等体外模型，对药物中已知或预测的dna反应性杂质进行检测；风险评估是根据实验室检测的结果，对药物中dna反应性杂质的致癌风险进行评估。

5、基因毒性杂质的限度控制通常采用毒理学关注阈值法(ttc法)，即根据毒理学数据确定一个安全的暴露水平，规定原料药及制剂中基因毒性杂质的ttc值不超过1.5μg/d。ttc值是指每天接触某种化合物不会引起任何可察觉风险的最大剂量。吡仑帕奈的最大日剂量为12mg，因此其基因毒性杂质的控制限度为0.0125％。

6、由于基因毒性杂质限度较低，检测方法一般需要用液相色谱-质谱联用(lc-ms)或气相色谱-质谱联用(gc-ms)，lc-ms和gc-ms是将液相色谱或气相色谱与质谱仪结合在一起，可以同时进行分离、鉴定和定量分析，但这些仪器成本高昂，不是每个药企qc部门都能够使用。常规液相色谱方法是利用不同化合物在移动相和固定相之间的相互作用，实现分离和定量分析，与lc-ms或gc-ms相比，具有仪器成本低、操作简便、灵敏度高等优点。因此，开发常规液相色谱方法检测遗传毒性杂质更具有现实意义。

技术实现思路

1、本发明提供了一种同时检测吡仑帕奈中五种基因毒性杂质的检测方法，使其专属性、检测限、定量限、线性及范围、重复性、准确度、耐用性等方面完全符合标准且具有较高的精密度，可用于吡仑帕奈的质量控制和安全性评估。

2、具体地，本发明提供了下述的技术方案。

3、在本发明第一方面，提供了一种检测吡仑帕奈原料药中基因毒性杂质的方法，所述方法通过高效液相色谱法检测吡仑帕奈原料药中的五种基因毒性杂质，所述方法包括以磷酸溶液作为流动相a，以乙腈为流动相b，并采用乙腈-流动相a作为杂质对照品溶剂；

4、所述五种基因毒性杂质的结构及名称如下表所示：

5、

6、

7、在本发明的实施方式中，所述流动相a为0.08-0.12％的磷酸溶液，优选为0.1％的的磷酸溶液。

8、在本发明的实施方式中，所述杂质对照品溶剂为体积比60：40的乙腈和流动相a的混合液。

9、在本发明的实施方式中，所述方法包括：

10、以乙腈溶解吡仑帕奈样品制备供试品溶液；

11、杂质l、杂质n、杂质o、杂质k、杂质d作为杂质对照品，以体积比为60:40的乙腈-流动相a的混合溶液溶解并稀释各杂质对照品制备杂质对照品溶液贮备液，并以乙腈稀释制备对照品溶液；

12、分别将供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪进行检测并记录色谱图，采用外标法以峰面积计算供试品溶液中五种基因毒性杂质的含量。

13、在本发明的实施方式中，所述高效液相色谱仪的检测条件为：

14、色谱柱：十八烷基硅烷色谱柱，capcell pak adme hr c18(150mm×4.6mm，3μm)

15、流动相a：0.08-0.12％磷酸溶液，优选为0.1％磷酸溶液；

16、流动相b：乙腈

17、流速：0.75-0.85ml/min，优选为0.8ml/min；

18、柱温：23-27℃，优选为25℃；

19、检测波长：208-212nm，优选为210nm；

20、进样量：10μl。

21、在本发明的实施方式中，采用梯度洗脱方式，梯度洗脱程序为：

22、流动相a和流动相b的初始比例为80:20；

23、第0～35min，降低流动相a的比例，同时提高流动相b的比例至两者比例为42:58；

24、第35～45min，保持流动相a和流动相b的比例为42:58；

25、第45～50min，提高流动相a的比例，同时降低流动相b的比例至回到初始比例80:20；

26、第50～60min，保持流动相a和流动相b的比例为80:20。

27、在本发明的实施方式中，杂质k的线性范围为0.2086μg/ml～2.0862μg/ml，杂质l的线性范围为0.3086μg/ml～2.0573μg/ml，杂质o的线性范围为0.2059μg/ml～2.0591μg/ml，杂质n的线性范围为0.2074μg/ml～2.0741μg/ml，杂质d的线性范围为0.2496μg/ml～1.9970μg/ml。

28、在本发明的实施方式中，所述方法的检测限低至0.103μg/ml，定量限低至0.2059μg/ml。

29、在本发明的实施方式中，计算杂质含量的公式为：

30、供试品溶液中各基因毒性杂质的含量(％)＝f平均×ai×vi/mi×100％

31、其中：f＝ms×cs/(vs×as)；

32、式中：f为响应因子；ms为对照品溶液中各基因毒性杂质的称样量；

33、cs为各基因毒性杂质的含量，％；vs为对照品溶液中各基因毒性杂质的总稀释体积；as为对照品溶液中各基因毒性杂质的峰面积；f平均为响应因子的平均值；ai为供试品溶液中各基因毒性杂质的峰面积；mi为供试品的称样量；vi为供试品的稀释体积。

34、在一些实施方式中，探索了不同流动相a、不同对照品溶剂、不同柱温、不同检测波长、不同洗脱方式，比如，在一些实施方式中，将流动相a更换为0.1％乙酸铵溶液(用冰醋酸调节ph值至4.0)或者0.01mol/l磷酸二氢钾溶液(磷酸调节ph值为3.0)；比如，在一些实施方式中，将对照品溶剂更换为50％乙腈；比如，在一些实施方式中，将供试品溶剂更换为n,n-二甲基甲酰；比如，在一些实施方式中，将检测波长更换为220nm及以上；比如在一些实施方式中，改变梯度洗脱条件或者将梯度洗脱方式变更为等度洗脱(比如流动相a:b＝60:40)；比如，在一些实施方式中，将柱温更换为30℃及以上；在这些实施方式中，检测结果都有一些不理想的地方，比如会出现例如基线波动大，和/或各待测杂质之间分离度较低、甚至难以分离，和/或待测杂质与未知杂质难以分离或供试品难以溶解等等的情况。

35、在本发明的一些较优的实施方式中，所述检测吡仑帕奈原料药中基因毒性杂质d、k、l、n和o的方法包括：

36、1、色谱条件：

37、仪器：agilent 1260

38、色谱柱：capcell pak adme hr c18(150mm×4.6mm，3μm)；

39、流动相a：0.1％磷酸溶液；

40、流动相b：乙腈；

41、流速：0.8ml/min；

42、柱温：25℃；

43、检测波长：210nm；

44、进样量：10μl；

45、梯度洗脱，洗脱程序如表1中所示：

46、表1：梯度洗脱程序

47、 时间(分钟) 流动相a(％) 流动相b(％) 0 80 20 35 42 58 45 42 58 50 80 20 60 80 20

48、2、检测方法

49、(1)配制供试品溶液：取吡仑帕奈样品80mg，精密称定，置10ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；

50、(2)配制对照品溶液：分别取杂质l、杂质n、杂质o、杂质k、杂质d对照品各约10mg，精密称定，置同一10ml量瓶中，用乙腈-流动相a(60：40)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液贮备液；精密量取0.1ml对照品溶液贮备液，置100ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得；

51、(3)分别精密量取供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，采用外标法以峰面积计算供试品溶液中杂质l、杂质n、杂质o、杂质k、杂质d的含量，含量计算方法同上。

52、在本发明的第二方面，提供了选自如下所示的五种物质在吡仑帕奈原料药或其制剂质量控制中的应用；

53、

54、在本发明的实施方式中，所述五种物质为基因毒性杂质，在质量控制中作为杂质对照品使用。

55、相较于现有技术，本发明的优势包括：

56、本发明的方法使得本发明所述五种基因毒性杂质即杂质d：(2-(6'-氧代-1'-苯基-1',6'-二氢-[2,3'-联吡啶]-5'-基)溴苯、杂质k：(5'-(2-氰基苯基)-6'-氧代-1'-苯基-1',6'-二氢-[2,3'-联吡啶]1-氧化物)、杂质l：邻溴苯乙酸、杂质n：(2-(2-溴苯基)-n-苯基乙酰胺)和杂质o：2-(2-氰基苯基)-n-苯基乙酰胺)彼此之间以及与吡仑帕奈之间均能有效分离，分离度均在2.8以上，且峰型对称性较好，利于各基因毒性杂质的检出，具有较高的专属性。并且本发明所述方法线性好、检测限低至0.103μg/ml，定量限低至0.2059μg/ml，在检测限、定量限、线性与范围、重复性以及耐用性上表现出无可拟比的优势，具有较高的精密度。