一种离体电生理实验的方法与流程

本发明属于生物，具体涉及一种离体电生理实验的方法。

背景技术：

1、重组腺相关病毒(recombinant adeno-associatedvirus,raav)载体是当前科学研究的重要工具，也是基因治疗中最有希望的基因递送载体之一。研究人员通过改造野生型腺相关病毒的衣壳结构或基因组结构，可以得到多种多样具有不同组织器官靶向性、表达不同外源基因、具有特殊调控能力的raav。在神经科学领域，研究人员常使用携带荧光蛋白基因的raav载体来靶向特定类型细胞，荧光蛋白标记可以帮助研究人员针对性地观察、操控细胞，并结合进一步的免疫组织化学、原位杂交、离体电生理等实验，达到神经环路标记示踪等目的。作为外源基因，细胞内表达的荧光蛋白可能存在占用过多细胞资源、在细胞内积累等问题，从而导致细胞毒性、影响研究结果。例如，在神经科学的离体电生理实验中，经raav感染并表达荧光蛋白的神经元可能存在荧光表达强度过高、积累时间过长的问题，这一方面不利于细胞维持正常的电生理特性，另一方面不利于实验人员对单个细胞进行精准操作。因此，优化raav递送的荧光蛋白的特性、防止荧光蛋白的过度积累、开发出一种能表达低丰度的荧光蛋白的raav将有助于电生理实验开展，如方便膜片钳实验中研究人员定位单个细胞、维持细胞较好活性。

技术实现思路

1、为了满足现有电生理学研究中表达低丰度、低毒性荧光蛋白的需求，本发明旨在提供一种离体电生理实验的方法。

2、为了获得低丰度荧光蛋白表达能力的重组腺相关病毒，通过直接改造荧光蛋白来降低表达强度和毒性具有一定难度，因此本发明尝试通过降低转录水平、增加翻译后调控来控制荧光蛋白的积累量。pest序列是小鼠鸟氨酸脱羧酶c端的氨基酸序列，其特性为富含脯氨酸/proline(p)、谷氨酸/glutamic acid(e)、丝氨酸/serine(s)和苏氨酸/threonine(t)，可以促进蛋白通过泛素-蛋白酶体途径降解。大肠杆菌二氢叶酸还原酶不稳定域(e.coli dihydrofolate reductase destabilization domain,ecdhfr dd)是一种源自大肠杆菌的蛋白不稳定区域，具有促进蛋白降解的作用。通过表达荧光蛋白-pest或荧光蛋白-dd的融合蛋白，可以降低荧光蛋白的半衰期，将荧光蛋白的表达丰度控制在较低水平。此外，还可以通过降低转录水平来控制荧光蛋白的表达，例如，四环素反应元件(tetracycline-responsive element，tre)启动子是一种可诱导的启动子，当细胞中不存在四环素转录活化因子tta时，tre具有极低的启动子活性，但存在泄露表达微量荧光蛋白的情况，利用tre-tta系统的这一特性也可控制微量荧光蛋白表达，且可以达到标记细胞较稀疏的效果。本发明将荧光蛋白基因序列与低转录水平的启动子序列tre构建在一个raav基因组中，或将荧光蛋白基因序列与促进蛋白降解的元件的基因序列(pest序列或ecdhfrdd序列)构建在一个raav基因组中，从而达到制备表达低丰度荧光蛋白的raav的目的。

3、本发明的一个实施方式是将荧光蛋白基因序列与pest基因序列或ecdhfr dd序列构建在同一个raav基因组中，使得荧光蛋白与pest肽段或荧光蛋白与ecdhfr dd肽段可以被表达为融合蛋白。该raav基因组中还包含启动子序列、转录调控序列，从而保证完整的荧光蛋白融合蛋白的表达。同时，该raav基因组可以包被不同血清型的衣壳，由于raav衣壳的血清型决定了其具有不同的组织器官嗜性，因此该raav可以达到在特定的组织、器官中表达低丰度的荧光蛋白的目的。

4、本发明的另一个实施方式是在raav基因组中构建tre启动子序列与荧光蛋白基因序列，荧光蛋白基因序列位于tre启动子下游，使得tre启动子能够控制荧光蛋白基因的转录。在不存在tta的情况下，tre启动子具有微弱的泄露表达，从而表达少量的荧光蛋白。该raav基因组中还包含启动子序列、转录调控序列，从而保证荧光蛋白能通过tre启动子表达完整。该raav基因组可以包被不同血清型的衣壳，由于raav衣壳的血清型决定了其具有不同的组织器官嗜性，因此该raav可以达到在特定的组织、器官中表达低丰度的荧光蛋白的目的。

5、本发明的具体技术方案如下：

6、本发明提供一种离体电生理实验的方法，所述方法的步骤包括：

7、(1)将表达低丰度荧光蛋白的raav注射至目标组织或器官中；

8、所述表达低丰度荧光蛋白的raav基因组中含有如下a)-c)中的任一种：a)启动子序列、荧光蛋白基因序列和pest序列；b)启动子序列、荧光蛋白基因序列和ecdhfr dd序列；c)tre启动子序列和荧光蛋白基因序列，tre启动子序列位于所述荧光蛋白基因序列的上游；

9、(2)荧光蛋白表达一段时间后，对所述目标组织或器官进行离体电生理实验。

10、进一步地，所述离体电生理实验为膜片钳实验。

11、进一步地，a)中所述pest序列位于荧光蛋白基因序列的下游，且与荧光蛋白基因序列位于同一个表达框中，所述启动子序列位于荧光蛋白基因序列和pest序列的上游；

12、b)中所述ecdhfr dd序列位于荧光蛋白基因序列的下游，且与荧光蛋白基因序列位于同一个表达框中，所述启动子序列位于荧光蛋白基因序列和ecdhfr dd序列的上游。

13、进一步地，所述pest序列如seq id no.1所示，所述ecdhfr dd序列seq id no.2所示，所述tre启动子序列如seq id no.3所示。

14、进一步地，所述表达低丰度荧光蛋白的raav基因组中还包含转录调控序列。

15、进一步地，所述荧光蛋白选自egfp、bfp、cfp、gfp、yfp、rfp、irfp、cerulean、venus、egfp、ecfp、eyfp、ebfp、dsred、dtomato、tdtomato、mcherry、mkate、mapple、mbanana、mcitrine、morange、mplum、tagrfp、tagbfp、hrp中的任一种。

16、进一步地，所述启动子选自cag、camkiiα、car、cba、cd68、c-fos、chat、cmv、cr、ef1α、e-sare、gad67、gfap、gfap104、gfaabc1d、grm6、hgrk1、hsyn、hubc、lp1b、l7/pcp2、mbp、mck、mdlx、moxt、mth、nef、nestin、npy、nrl、pgk、pv、ram、rk、roh、rpe65、sfrp2、sst、tbg、tcap、th、thy1、tph2、tre、trpv1、uas、vgat中的任一种。

17、进一步地，所述调控序列选自转录和转录后调控序列wpre、opre、cw3sl、sv40polya、hgh polya、bgh polya、rbglob polya中的任一种。

18、进一步地，所述表达低丰度荧光蛋白的raav的血清型选自aav1、aav2、aav2-retro、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav9-retro、aav10、aav11、aav12、aav13、aav-dj、aav-php.eb、aav-myo及其衍生血清型中的任一种。

19、进一步地，所述组织选自神经组织、肌肉、上皮组织或结缔组织；

20、所述器官选自膀胱、眼、耳、鼻、口腔、舌、咽、喉、犁鼻器、唾液腺、肝、肾、脾、心、肠道、胃、胰腺、肺、气管、血管、淋巴管、淋巴结、四肢、垂体、甲状腺、甲状旁腺、胰岛、肾上腺或生殖器。

21、进一步地，所述神经组织选自中枢神经系统及其神经环路相关组织。

22、本发明具有以下优点：

23、将荧光蛋白基因序列与低转录水平的启动子序列构建在一个raav基因组中，或将荧光蛋白基因序列与促进蛋白降解的元件的基因序列构建在一个raav基因组中，从而达到制备表达低丰度荧光蛋白的raav，解决荧光蛋白在细胞表达强度过高、积累时间过长而导致的细胞毒性、影响研究结果以及不便对单个细胞进行精准操作等问题。具体地：

24、1.本发明raav表达低丰度的荧光蛋白，减少细胞内荧光蛋白聚积，降低了细胞毒性，对实验结果影响较小。本发明不改变荧光蛋白本身，而是将任意已有的荧光蛋白与tre启动子、pest或ecdhfr dd结合使用达到降低荧光表达丰度的目的，普遍适用于所有颜色的荧光蛋白。

25、2.本发明低丰度的荧光蛋白使得细胞在实验中更便于观测和区别于周围其他带有荧光的细胞，因此本发明中的raav对膜片钳等离体电生理实验具有帮助。例如对荧光标记的神经元进行膜片钳实验，标记稀疏且亮度适中的荧光有助于研究人员精确定位细胞膜位置，记录其电生理特性。

26、3.本发明结合不同的衣壳血清型，该表达低丰度荧光蛋白的raav适用于多种组织器官。