检测血液中多种维生素的含量的方法与流程

本发明大体涉及化学检测领域，具体涉及一种检测血液中多种维生素的含量的方法。

背景技术：

1、维生素可分为脂溶性维生素和水溶性维生素，维生素a、维生素d和维生素e属于常见的脂溶性维生素，是人体所必需的微量营养成分，对新陈代谢起调节作用。维生素a(vitamin a)又称视黄醇，孕妇缺乏或过量可造成胎儿先天畸形，如唇腭裂、先天性心脏病等，妊娠期间补充维生素a可提高血红蛋白水平、降低贫血的发生率。维生素d(vitamin d)的缺乏可能会导致佝偻病、骨密度降低、骨折、产后妇女骨质疏松。维生素e(vitamin e)水解产物为生育酚，生育酚能够促进性激素分泌，具有提高生育能力、预防流产的作用，缺乏维生素e可能会导致胎盘老化、胎膜早破等。因而，对人体中的多种维生素的含量进行检测具有重要的临床意义。

2、目前，通常是对人体血液中的维生素的含量进行检测，常规的检测方法有液相色谱法以及液相色谱-串联质谱联用法。现有的检测方法，通常是在样本前处理过程将血浆和有机试剂进行震荡混合以使蛋白沉淀，再加入萃取剂萃取，然后用复溶液进行复溶，用液质联用仪分析。然而，在样本前处理过程和萃取过程中，往往需要剧烈振荡、充分混合后才能将水相中的脂溶性维生素萃取到有机相溶剂中，此过程易导致溶液发生乳化现象，与此同时，有机溶剂与水相溶剂会互相发生微量溶解，导致溶液分层不明显、转移有机相溶液不方便，造成待测维生素的损耗，从而导致产生实验间偏差，影响检测结果准确性。特别地，人血液中的维生素a和维生素e的含量不高，通常为微克级，而维生素d的含量极低，为纳克级，检测时应尽量减少维生素的损耗。

3、因此，需要提供一种高准确性的人体血液中多种维生素含量的检测方法。

技术实现思路

1、本发明是有鉴于上述现有技术的状况而提出的，其目的在于提供一种准确性高的检测血液中多种维生素的含量的方法。

2、为此，本发明提供了一种检测血液中多种维生素的含量的方法，包括分别提供待测血清样本和标准样本；向所述待测血清样本和所述标准样本加入内标溶液；加入第一沉淀剂，进行混合，其中所述第一沉淀剂为浓度7.8g/ml至10g/ml的硫酸锌溶液；加入第二沉淀剂，进行混合，其中所述第二沉淀剂包括乙腈和甲醇；加入萃取剂，进行萃取；加入复溶液，进行复溶，得到待测溶液和标准溶液；采用液相色谱串联质谱法对所述待测溶液和所述标准溶液进行检测；根据所述标准溶液的检测结果得到标准曲线，根据所述待测溶液的检测结果和所述标准曲线，得到所述待测血清样本中所述多种维生素的含量；其中，所述多种维生素为维生素a、维生素d2、维生素d3和维生素e，所述标准样本为具有特定浓度的维生素a、维生素d2、维生素d3和维生素e的溶液，所述内标溶液为具有特定浓度的带有同位素标记的维生素a、维生素d2、维生素d3和维生素e的溶液。

3、在本发明中，在样本前处理过程中，加入第一沉淀剂(浓度7.8g/ml至10g/ml的硫酸锌溶液)，高浓度的硫酸锌溶液能够与蛋白质争夺水分子，破坏蛋白质胶体颗粒表面的水膜，且能够中和蛋白质颗粒上的电荷，使水中蛋白质颗粒积聚而沉淀析出，改变样本中蛋白质在水溶液中的溶解性，促进蛋白质沉淀、分离，从而能够有利于减少对后续检测的影响；另外，高浓度的硫酸锌溶液还能够改变水相溶剂中的极性，减少有机溶剂与水溶液发生相互溶解或者产生乳化现象，有利于减少后续样本处理中的维生素的损耗，由此，能够有利于提高对血液中的维生素a、维生素d2、维生素d3和维生素e检测的准确性。加入第二沉淀剂(乙腈和甲醇)，能够增加水的极性，促进两相分离，从而能够进一步促进样本中蛋白的沉淀。此外，加入第一沉淀剂(硫酸锌的水溶液)还能够对样本进行稀释，从而使样本中蛋白的浓度降低，从而减少蛋白之间的相互作用和干扰，再加入第二沉淀剂，能够有利于进一步促进样本中蛋白的沉淀。

4、在本发明所涉及的方法中，可选地，所述第二沉淀剂包括还包括稳定剂，所述稳定剂为丁基羟基茴香醚，所述稳定剂溶于甲醇中，质量分数为0.1％。在这种情况下，由于维生素a和维生素e置于空气中均容易发生氧化反应，在沉淀剂中加入丁基羟基茴香醚，能够有利于维持维生素a和维生素e在沉淀步骤的稳定性，减少维生素a和维生素e的损耗，从而提高检测准确性。

5、在本发明所涉及的方法中，可选地，所述第二沉淀剂中，乙腈和丁基羟基茴香醚质量分数为0.1％的甲醇的体积比为1:1。由此，能够有利于提高检测结果的准确性。

6、在本发明所涉及的方法中，可选地，所述萃取剂为正己烷。由此，能够有利于维生素的回收，提高检测的准确性。

7、在本发明所涉及的方法中，可选地，所述复溶液包括水和具有所述稳定剂的甲醇。在这种情况下，在复溶时加入稳定剂，能够有利于维持维生素a和维生素e在复溶步骤的稳定性，减少维生素a和维生素e的损耗，从而提高检测准确性。

8、在本发明所涉及的方法中，可选地，所述复溶液中，水和具有所述稳定剂的甲醇的体积比为3:7。由此，能够有利于维生素的回收，提高检测的准确性。

9、在本发明所涉及的方法中，可选地，进行液相色谱时，色谱柱为c18色谱柱，柱温为40℃，进样量为10μl。在这种情况下，选用c18色谱柱，能够根据待测物分子极性大小进行选择性分离，能够对水相更加耐受，从而延长色谱柱的使用寿命；并通过选择合适的柱温和流动相，能够有利于获得良好的分离效果和提高检测的准确度。

10、在本发明所涉及的方法中，可选地，进行液相色谱时，流动相a为体积分数为0.1％的甲酸水溶液，流动相b为体积分数为0.1％的甲酸的甲醇溶液。在这种情况下，通过选择合适的流动相的组成，能够有利于获得良好的分离效果和提高检测的准确度。

11、在本发明所涉及的方法中，可选地，进行液相色谱时，为梯度洗脱，洗脱程序为：

12、

13、

14、在本发明所涉及的方法中，可选地，用于检测所述多种维生素及所述带有同位素标记的多种维生素的母离子和子离子对质荷比为：

15、 分析物 母离子 子离子 维生素a 269.300 93.100 维生素e 431.300 165.300 带有同位素标记的的维生素a 275.200 171.300 带有同位素标记的的维生素e 437.300 171.300 维生素d2 413.300 355.300 维生素d3 401.300 365.300 带有同位素标记的的维生素d3 404.300 386.300 带有同位素标记的的维生素d2 419.300 401.300

16、。

17、根据本发明，能够提供一种准确性高的检测血液中多种维生素含量的方法。